16ELECTROFORESISPAGE - 16 Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida Anlisis de protenas de hojas de Arabidopsis thaliana Ana Mara

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16. Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida. Análisis de proteínas de hojas de Arabidopsis thaliana Ana María Maldonado Alconada, Jesús V. Jorrín Novo Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba RESUMEN La electroforesis en geles de poliacrilamida es uno de los métodos más utilizados para la purificación, análisis y caracterización de proteínas. La técnica permite separar moléculas cargadas y explota diferencias en movilidad cuando se les somete a la acción de un campo eléctrico. La electroforesis se lleva a cabo sobre un soporte inerte, generalmente sobre geles de poliacrilamida (PAGE). En la electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE), como su propio nombre indica, se utilizan agentes desnaturalizantes de proteínas, como pueden ser: detergentes (p.e. SDS), caótropos (p.e. urea) y agentes reductores (2- mercaptoetanol, DTT). Para la visualización de las proteínas se utilizan diferentes métodos de tinción, siendo el más habitual el azul de coomassie. En la SDS-PAGE, la separación es función del tamaño (masa molecular), lo que permite determinar el peso molecular de las proteínas. Para ello se compara la movilidad electroforética (Rf) de la proteína de peso molecular desconocido con el de proteínas de referencia de peso molecular conocido. En esta práctica, en la que se pretende que el alumno comprenda el fundamento teórico de esta técnica y sus aplicaciones, se llevará a cabo la separación de proteínas de hojas de A. thaliana mediante SDS-PAGE. Palabras clave : Desnaturalizante, electroforesis, proteínas, rubisco. Abreviaturas empleadas : APS: persulfato amónico; DTT: ditiotetriol; PAGE: electroforesis en geles de poliacrilamida; SDS-PAGE: electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida; SDS: dodecil sulfato sódico; TEMED: N,N,N´,N´-tetrametilentilendiamina. 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 1.1. Separación electroforética de proteínas. La separación y purificación de proteínas son necesarias para llevar a cabo el estudio y caracterización del proteoma de los sistemas biológicos. Para ello, éstas deben ser separadas selectivamente a partir de muestras complejas mediante un procedimiento de fraccionamiento adecuado. Los métodos de 1
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