Unidad I - Unidad I Reactor Biolgico M en C Omar Cervantes...

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Unformatted text preview: Unidad I. Reactor Biolgico M. en C. Omar Cervantes Avils Objetivos Conocer los principales aspectos en los que se basa la bioingeniera. Comprender la cintica de crecimiento microbiano y su relacin con la bioingeniera. 1. Introduccin Qu es la Bioingeniera? Ciencia que estudia la aplicacin de principios y mtodos de las ciencias exactas, en general, y de la ingeniera en particular, a la solucin de problemas de las ciencias biolgicas y mdicas. (IEEE, 1999) Aplica los principios de la ingeniera al amplio espectro de los sistemas vivos. Operaciones unitarias Ingeniera electrnica Biologa molecular Ciencias Mdicas y neurociencias Farmacobiologa BIOINGENIERA Microbiologa Biotecnologa Bioqumica Ingeniera civil Arquitectura Campos de competencia Salud (Medicina) Farmacutica Ciencias Ambientales Alimentos Tiene la habilidad de explotar nuevas oportunidades y solucin de problemas de sistemas complejos (sistemas vivos) Productos de bioingeniera Medicina: Equipos para mdicos (RMN) Prtesis Desarrollo de tejidos invitro Farmacologa Desarrollo de nuevos medicamentos Renovacin de suelos Desarrollo de nuevos productos Industrializacin de productos fermentados regionales Ciencias ambientales Alimentos Ciencia multidisciplinaria que mediante el uso de microorganismos, clulas de animales y plantas, adems de otros componentes de las clulas como las enzimas, y la aplicacin de los principios de ingeniera; se desarrollan diversos productos y el aprovechamiento de algunos desechos peligrosos, para beneficio del ser vivo. Si bien, el campo de la bioingeniera es amplio, en este curso nos enfocaremos especficamente en ingeniera de biorreactores, para el mejor entendimiento de la materia. Productos biotecnolgicos desarrollados a partir de la bioingeniera: rea Producto Medicina Farmacutica Desarrollo de tejidos y rganos invitro Desarrollo medicamentos de nuevos Ciencias ambientales Alimentos Renovacin de suelos Desarrollo de nuevos productos 2. Estequiometra crecimiento microbiano producto. de y Para el estudio de la cintica microbiana se deben de tomar en cuenta los mtodos experimentales adecuados para determinar el crecimiento de las poblaciones de microorganismos, los cuales deben considerar: Modo de reproduccin de las procariotas y eucarioras Las condiciones generales de (naturaleza del medio de cultivo). clulas cultivos Clulas procariotas: Reproduccin binaria. Edad mxima de cada clula es el lapso comprendido entre 2 replicaciones sucesivas. En sistemas por lotes para estos microorganismos la edad del cultivo se define como el tiempo transcurrido desde la inoculacin. Las clulas bacterianas se encuentran en forma individual o en asociaciones dbiles pudiendo ser dispersadas homogneamente en el lquido. Hongos, organismos eucariota: Los tipos ms importantes son las levaduras y los hongos filamentosos Levaduras: se reproducen por gemacin por lo que un medio con levaduras es heterogneo en cuanto a la edad y estado fisiolgico de las clulas que lo componen. El mximo nmero terico de gemaciones esta dado por la razn del rea que ocupa cada cicatriz de gemacin y el rea superficial de la clula y es alrededor de 100, en la prctica no es usual detectar clulas con ms de 30 cicatrices. Los hongos filamentosos se reproducen por gemacin y esporas, pero lo que destaca en los fermentadores son las hifas ya que estas le dan al medio de cultivo caractersticas reolgicas no-newtonianas y alta consistencia al medio. Los cultivos de hongos filamentosos son heterogneos desde la perspectiva fsica y fisiolgica. Tomando en cuenta lo antes mencionado los mtodos para cuantificacin del crecimiento microbiano son Mtodos En base al numero de clulas Recuento directo Conteo directo en celda Requiere clulas individuales y medio liquido Fundamento Observaciones Recuento en placa Nefelometra Conteo de colonias Dispersin de la luz Requiere clulas individuales, gran influencia de las condiciones de incubacin, demora 24 h Requiere cultivo homogneo traslucido N.M.P. En base a masa celular Peso seco Turbidimetra Estadstico Requiere clulas individuales y medio liquido Medicin directa Transmisin de la luz No admite slidose en el medio, delicado y largo Requiere clulas individuales y medio limpio Volumen empacado Fsicos y Qumicos Centrifugacin Indirectos, variados: cambios de viscosidad o pH, anlisis de componentes celulares, consumo de nutrientes Conservacin de la masa, representacin estequiomtrica del crecimiento microbiano. Poco preciso Mtodos aproximados requieren de gran estandarizacin Requiere de gran cantidad de datos analticos y censores en lnea Balance de masa Medios de cultivo Requerimientos nutricionales Clula Madre Clula Madre Clula hija Materia Energa Informacin Clulas Productos Informacin para la construccin de la nueva clula esta contenida en el cromosoma y es transmitida de generacin en generacin. Materia debe ser suministrada a travs de los componentes del medio de cultivo. Energa se obtiene del catabolismo de la fuente de carbono y energa, de reacciones inorgnicas de oxidacin o de la radiacin solar en el caso de organismos fotosintticos. Es posible representar el crecimiento microbiano mediante una ecuacin qumica que se rija por los principios de la estequiometra: 1 Ca H b O c m NH3 n O2 q Cd HeOf Ng Ecuacin 1 r CO 2 t H 2 O u Ch H i O j N k En la ecuacin anterior, la biomasa se representa en base a su composicin elemental: Elemento % en peso, base seca Bacterias 46 - 53 Levaduras 46 - 51 Mohos 45 - 55 Carbono Hidrgeno Oxgeno 6.5 7.5 18 32 10 14 68 28 35 6 10 8 12 18 24 37 Nitrgeno Magnesio Fsforo Azufre Calcio Potasio 0.1 0.5 2.0 3.0 0.1 1.0 0.01 1.1 1.0 4.5 0.1 0.5 0.8 2.6 0.01 0.24 0.1 0.3 1.0 4.0 0.1 0.3 0.4 4.5 0.1 0.5 0.1 1.4 0.2 2.5 Hierro 0.02 0.2 0.01 0.5 0.1 0.2 Los elementos cuantitativamente ms importantes son C, H, O y N, lo que justifica la aproximacin hecha en la ecuacin (1). El Mg, S, P, Ca, Na y K son el siguiente grupo importante. Los restantes se encuentran en niveles mas bajos. Estos elementos deben ser suministrados como compuestos aptos para ser metabolizados. Fuente de carbono: carbohidratos compuesto orgnico, CO2, carbonato bicarbonato (para clulas quimioautotrficas y fotosintticas) Fuente de nitrgeno Amonio nitrgeno amonio de aminocidos y protenas urea nitratos nitrgeno elemental El resto de los elementos son proporcionados por sales inorgnicas. Debido a deficiencias genticas, ciertas cepas requieren de factores de crecimiento, tales como vitaminas, aminocidos y nucletidos. Tipos de medios de cultivo Complejos: son formulados en base a desechos, subproductos y extractos naturales, tales como melaza, licor de maceracin de maz, extracto de levadura, y otros. Su composicin qumica es compleja y variable y contienen varias fuentes de cada elemento. Estos medio pueden requerir suplementacin con compuestos que proporcionen cantidades adicionales de algunos elementos, tales como N, Mg y P. Los medios complejos son extensamente utilizados en microbiologa bsica (taxonoma, fisiologa, gentica), microbiologa analtica, microbiologa de aguas y alimentos y en fermentaciones industriales. Definidos: se formulan en base a compuestos puros, tales como glucosa, sulfato de amonio, metionina, fosfato monocido de potacin, etc. Debido a ello su composicin qumica es conocida y reproducible, conteniendo fuentes de cada elemento y los nutrientes esenciales que pueden ser requeridos. Estos medios son usados preferentemente en investigacin y desarrollo de procesos de fermentacin. En el campo industrial, se percibe una creciente utilizacin de medios definidos. Una clase especial de medio definido es el medio mnimo, que se puede caracterizar como aquel formado por solo una fuente de cada elemento. El tpico medio mnimo esta compuesto por glucosa, sulfato de amonio y otras sales minerales. Medio Complejo Vs Medio mnimo Medio complejo Uso en la industria X Medio mnimo Medio econmico Mejor control de condiciones ambientales X X Estequiometra Permite determinar la relacin entre la masa y/o moles de los reactantes consumidos y los productos formados. Esta informacin es deducida de la ecuacin estequiomtrica y los pesos moleculares de sus componentes Si se considera la reaccin principal en la fermentacin alcohlica, la reaccin neta de conversin de glucosa a etanol y dixido de carbono: C 6 H12O 6 2 C 2 H 6 O 2 CO 2 Ecuacin 2 Se conserva tanto la masa total, como el nmero de elementos de cada tomo. En la prctica, la estequiometra es difcil de conocer con precisin; ya que los reactivos usualmente no son adicionados en las proporciones exactas indicadas en la ecuacin. Adems los reactivos tambin forman productos no considerados en la ecuacin principal, sin embargo, estos productos tambin forman parte de la mezcla de reaccin. Reactivo limitante: Es el reactivo presente en pequeas cantidades estequiomtricas. Reactivo en exceso: Es el reactivo presente en cantidades mayores a las requeridas estequiomtricmente, y que se combinado con el reactivo limitante, para formar un producto. Ejemplo (1): La reaccin para la conversin de glucosa a L-cido glutmico, es como se muestra a continuacin: C6 H12O 6 NH 3 3 2 O2 C5 H 9 NO 4 CO 2 3 H 2O Cuanta masa de O2 es requerida para producir 15 g de cido glutmico? Otros trminos: Conversin: fraccin o porcentaje de reactivo convertido en producto. Grado de conversin: fraccin o porcentaje de reactivo limitante convertido en producto. Selectividad: es la cantidad de un producto en particular formado expresada como la fraccin de la cantidad total de los productos formados, si los reactivos han sido transformados en su totalidad. Rendimiento: es la razn de masa o moles de producto formado por la masa o moles de reactivos consumidos. Ejemplo (2) "Reaccin incompleta y rendimiento": Dependiendo de las condiciones del medio de cultivo l glucosa puede ser catabolizada por levaduras para la produccin de etanol y dixido de carbono o puede ser desviada hacia la biosntesis de otros productos. Un inculo de levadura es adicionado a una solucin conteniendo 10 g/L de glucosa. Despus de cierto tiempo de cultivo, solo 1 g/L de glucosa queda sin consumir y la concentracin final de etanol es de 3.2 g/L. Determinar: a) la fraccin de conversin de glucosa a etanol, y b) el rendimiento de etanol por glucosa consumida c) los gramos de glucosa son utilizados para la produccin de etanol Rendimiento de nutrientes en clulas Yx/s Masa celular obtenida por unidad de nutriente consumido YX / S X S masa celular producida nutriente consumido Ecuacin 3 Este parmetro puede relacionar las velocidades de variacin de biomasa y de consumo de sustrato (nutriente). dX dt YX / S Ecuacin 4 dS dt Cintica de crecimiento dX dt X Ecuacin 5 El papel del oxigeno molecular en el metabolismo aerobio es actuar como aceptor final de electrones. Por conveniencia se define un rendimiento de oxigeno en clulas, YO2, de manera similar al rendimiento de un nutriente. Igualando dX/dt en las ecuaciones 4 y 5, tenemos: dS X YX / S dt Reacomodando trminos, X YX / S dS dt Ecuacin 6 El rendimiento de la fuente de carbono y energa depende de la velocidad especfica de crecimiento. Para encontrar esa relacin se recurre a un balance de masa de la fuente de carbono y energa: ST SC Ecuacin 7 SM SP El sustrato consumido = al sustrato utilizado para crecimiento, manutencin de la viabilidad y el producto El trminos de crecimiento engloba el sustrato consumido para formar parte de la biomas a y para generar energa para la biosntesis. El trmino de manutencin se refiere al sustrato utilizado para generar energa para las funciones distintas al crecimiento: transporte de nutrientes, equilibrio osmtico, etc. El trmino de producto puede o no estar presente, segn el microorganismo considerado y las condiciones de cultivo. Dividiendo la ecuacin 7 por t y llevando al lmite cuando sta tiende a cero: dS dt T dS dt C dS dt M dS dt Ecuacin 8 P Si no hay produccin de metabolito extracelular y se reemplaza cada trmino en funcin de parmetros del cultivo, dS dt dS dt dS dt Ecuacin 9 M T C Considerando la ecuacin 6, tenemos: Donde YX0 / S se define como la biomasa X X mX M YX / S T YX / S C obtenida por unidad de sustrato Ecuacin 10 consumido destinado Eliminando al crecimiento, por dividiendo la tanto no puede ecuacin anterior medirse entre X tenemos, directamente por anlisis qumico 1 1 1 YX / S YX / S 0 m Ecuacin 11 Como el rendimiento mximo no puede medirse directamente por anlisis qumicos, este parmetro es un lmite terico que puede ser determinado por extrapolacin como se muestra en la siguiente figura. Relacin de YX/S con para la fuente de carbono y energa. a) Relacin hiperblica b) Linearizacin de YX/S (ecuacin 11) Si se hace un balance de los contenidos de un elemento en la clula, con su nutriente respectivo tenemos: Yx/s % de elemento en nutriente % de elemento en biomasa Ecuacin 12 La ecuacin 12, considera que todo el nutriente se utiliza en crecimiento y por lo tanto supone nula la cantidad utilizada para manutencin y produccin, por lo que el valor calculado corresponde ms bien al rendimiento mximo. En cuanto a la fuente de carbono y energa, no todo el carbono metabolizado aparece en la biomasa, sino que una porcin forma parte de los productos de oxidacin (CO2 y molculas pequeas en metabolismo anaerobios). Para este caso se tiene que: Yx/s % de elemento en nutriente f % de elemento en biomasa Ecuacin 13 Siendo f, en el metabolismo aerobio comprende entre 0.5 y 0.6 y para crecimiento anaerobio 0.1. Diseo de Medio de Cultivos Para la formulacin de medios de cultivo se debe conocer: La concentracin celular que se desea obtener, La composicin elemental de la biomoasa (normalmente de datos generales), Las fuentes de cada elemento que se utilizarn como nutrientes, Los requerimientos de factores de crecimiento El clculo, para la formulacin del medio, se realiza determinando YX/S para cada nutriente con ayuda de las ecuaciones 12 y 13, para poder calcular la concentracin de cada uno a partir de la ecuacin 3: S0 Sf X f X0 YX / S Ecuacin 14 El valor de Sf se supone cero en primera instancia. Luego los valores de S0 obtenidos pueden multiplicarse por 1.1 1-5, a excepcin del nutriente que se quiere sea el limitante. Cintica de formacin de producto El rendimiento de producto, como se mostr anteriormente, se define de forma anloga al rendimiento celular: YP / S ( P S )T producto formado nutriente total consumido Ecuacin 15 Y0 P/S ( P S )P producto formado fuente de C y energa consumida para producto Ecuacin 16 ser determinado YP / S puede YP0/ S experimentalmente e puede ser calculado de datos experimentales linearizando el equivalente a la ecuacin 11, pero ahora se debe considerar el trmino de formacin de producto qP. Si qP es conocido y constante, y se conoce el valor de m, entonces: 1 YX / S 1 Y0 qP 1 m YP0/ S Ecuacin 17 X /S Otra forma de estimar es determinar el rendimiento terico de YP*/ S . un metabolito, YP0/ S YP*/ S son tiles como referencia Los valores de para evaluar el comportamiento de un fermentacin y adoptar decisiones sobre acciones a seguir. YP*/ S muy alejado de YP / S implica que el Un proceso puede ser mejorado invirtiendo recursos en investigacin y desarrollo. YP*/ S cercanos a YP / S aconsejan no Valores de invertir en mejorar ms ese proceso. Para evaluar un proceso industrial, adems de los rendimientos se requiere considerar el aspecto cintico, ya que no es lo mismo obtener una cierta conversin de sustrato a producto en un corto tiempo que en un lapso prolongado. Tambin es importante obtener una alta concentracin de producto que reduzca los costos de recuperacin. Un parmetro que considera lo anterior es la productividad volumtrica, referida a un metabolito (QP) o a biomasa (QX). Productividad volumtrica masa obtenida tiempo * volumen Ecuacin 18 Por tanto: QX dX dt QX dP dt Ecuacin 19 Ecuacin 20 Para evaluar fermentacin, aproximacin: globalmente es vlida una la X P QX Ecuacin 21 Ecuacin 22 QX t t Analticamente se puede calcular QX como: dX X X0 QX dt t t 1 ln X Ecuacin 23 m l X0 Productividad volumtrica de biomasa o producto Cuando el objeto es evaluar o comparar la capacidad de diversas cepas para producir un determinado metabolito, resulta ms adecuada la productividad especfica. Ecuacin 24 qP 1 dP X dt Ejercicio 3: La ecuacin para la produccin aerbica de cido actico a partir de etanol es: C2 H5OH O2 CH3CO2H H2O Acetobacter aceti es adicionada a un medio que contiene 10 g/L de etanol, vigorosamente aireado. Despus de cierto tiempo, la concentracin de etanol es de 2 g/L y de cido actico de 7.5 g/L producido. Cules el rendimiento del cido actico con respecto al etanol?, compare con el rendimiento terico. 3. Modelos Cinticos Para el tratamiento cuantitativo de los procesos de fermentacin conocer la cintica de crecimiento y produccin es muy importante. Conocer la cintica de un cultivo permite: La prediccin del transcurso fermentacin La evaluacin de velocidades Rendimientos y productividades de la El comportamiento cintico de una poblacin esta determinado por factores genticos y ambientales. Entre los ambientales tenemos: Las condiciones de operacin: composicin del medio, temperatura, pH y otras. Modalidad del cultivo: por lotes, continuo o semi-continuo. El cultivo por lotes se define como aquel que se realiza sin intercambio de materia con los alrededores, salvo lo referente a los gases (aireacin, produccin de CO2 y otros), los que se suministran y retiran del sistema en forma continua. En esta modalidad de cultivo se cargan inicialmente los nutrientes y luego se inocula con una determinada cantidad de clulas viables. Curva de crecimiento en cultivo por lotes Condiciones de este comportamiento: cultivo es por lotes, todas las clulas que componen la poblacin se reproduzcan a intervalos regulares, no existan sustancias inhibidoras del crecimiento y la composicin del medio sea simple. La curva presenta varias fases: Fase latente, a: se produce inmediatamente de la inoculacin en esta zona no hay crecimiento celular. Fase crecimiento exponencial b: reproduccin de clulas a la mxima velocidad (no existe limitacin de nutrientes). Fase estacionaria, c: se alcanza cuando se agota un nutriente, razn por la cual se detiene el crecimiento. Fase de muerte o decaimiento, d: los cultivos inducen enzimas autolticas en condiciones de inanicin. Fase de crecimiento crptico, e: el contenido citoplasmtico de las clulas lisadas proporciona nutrientes para el crecimiento de las clulas remanentes. Es posible distinguir tambin cortas fases de aceleracin y desaceleracin del crecimiento. La fase estacionaria puede presentar una leve pendiente positiva si el nutriente limitante es, por ejemplo, la fuente de nitrgeno. En ese caso el catabolismo de la fuente de carbono y energa puede continuar por algn tiempo, con acumulacin de compuestos de reserva y aumento de la biomasa. Si se utiliza nmero de clulas en vez de biomasa, aparecen algunas diferencias en la curva. En la fase de latencia no hay aumento de clulas viables, las que incluso pueden disminuir. En cuanto a la fase estacionaria, no se apreciar aumento de pendiente en los casos de limitacin por nitrgeno. El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser representado por: dX dt X Ecuacin 5 Donde (velocidad especfica de crecimiento, t-1) es constante en el crecimiento exponencial. Despejando de la ecuacin 5: 1 dX Ecuacin 25 X dt En la fase exponencial es posible integrar la ecuacin: X ln t X0 Ecuacin 26 Reagrupando: X X 0e t Ecuacin 27 Relacionado con existe otro parmetro cuya interpretcin fsica es ms directa: el tiempo de duplicacin td, definido como el tiempo que media entre dos duplicaciones sucesivas. Integrando la ecuacin 5 en estos lmites: td ln 2 Ecuacin 28 La curva de crecimiento puede ser empleada con seguridad para organismos procariotes y levaduras, para hongos filamentosos se recomienda discrecin debido a que su crecimiento no es uniforme y tiene lapsos de crecimiento acelerado seguidos de lapsos en el que las hifas no crecen. Tipo de clula Bacterias Levaduras Hongos filamentosos Microalgas Clulas animales in vitro td (h) 0.3 2.5 1.0 4.0 1.5 7.0 18 35 20 - 40 Algunos rangos de valores de td tpicos Influencia de los factores ambientales: El valor de depende del microorganismo que se trate y de los parmetros ambientales del cultivo; Composicin pH, del medio de cultivo Eh Temperatura Presencia de agentes tensoactivos Actividad termodinmica del agua El efecto de la composicin del medio es tanto cualitativo como cuantitativo. La naturaleza de los nutrientes influye en el valor de , en especial de las fuentes de carbono y energa, y de nitrgeno. El efecto cuantitativo de la fuente de carbono y energa en fie estudiado por Monod (1949): S M KS S Ecuacin 29 Dependencia de la velocidad especfica de crecimiento con la concentracin de sustrato Como es dependiente de S, cuando el sustrato comprende valores d egramos o decenas de gramos por litro, se hace prcticamente M . Por lo anterior, M es una estimacin de la pendiente en la fase exponencial (curva de crecimiento) Nutriente Glucosa Glucosa Gnero Escherichia Aspergillus Ks (mg/L) 0.07 2.0 5.0 Glucosa Glucosa Lactosa Metanol Fosfato Magnesio Arginina Sacharomyces Candid Escherichia Pseudomonas Escherichia Klebsiella Aspergillus 25 4.5 20 0.7 1.6 0.56 0.56 Triptfano Escherichia 5*10-4 1*10-3 Para el caso de un cultivo afectado por concentraciones altas de sustrato o productos : S M KS S (I S ) KI Ecuacin 30 S M KI, constante de inhibicin por sustrato KP, constante de inhibicin por producto KS S (I P ) KP Ecuacin 31 El modelo de Monod no siempre representa adecuadamente los datos experimentales, en especial cundo el medio de cultivo es complejo y contiene varias fuentes de carbono y de nitrgeno. En estos casos pueden resultar ms adecuados otros modelos de crecimiento: Ecuacin logstica y sus modificaciones (Peleg, 1997, Blanch y Clarck, 1996) La temperatura es un factor ambiental importante que influye en la velocidad especfica de crecimiento. Ae Ea RT Ecuacin 32 Influencia de la temperatura en la velocidad especfica de crecimiento. La energa de activacin del crecimiento, Ea, vara en el rango de 8 a 26 kcal/mol, dependiendo del microorganismo y de la composicin del medio. La ubicacin de la temperatura ptima determina la clasificacin de microorganismos: Tipo de microorganismo Sicrfilos Mesfilos Termfilos Temperatura 0-15C 20-40C 45C o mas La relacin de con el pH presenta tambin un valor ptimo. Sin embargo la forma de la curva es ms variable que en el caso de la temperatura y no se dispone de un modelo matemtico simple y general para representarla. Tipo de microorganismo Bacterias Levaduras Hongos filamentazos pH 6 a 7.5 3.5 a 5.5 3a7 El potencial redox, Eh, del cultivo tiene tambin importancia, ya que su valor determina la posibilidad de ocurrencia de reacciones de oxidacin del sustrato y es especialmente relevante para organismos quimioauttrofos que utilizan una reaccin inorgnica como fuente de energa. Finalmente, Cabe mencionar la actividad termodinmica del agua, aw. Para su desarrollo los microorganismos requieren nieles mnimos de aw que posibiliten que el agua cumpla con su rol de solvente y reactante. Estos valores son normalmente mayores a 0.9, aunque existen hongos filamentosos y levaduras que pueden crecer a aw tan bajas como 0.6. La actividad de agua (aW) del medio representa la fraccin molar de las molculas de agua totales que estn disponibles, y es igual a relacin que existe entre la presin de vapor de la solucin respecto a la del agua pura (p/po). Mw p aW po M w M s El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metablicamente. Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las molculas de agua estn libremente disponibles para reacciones qumicas con el agua presente en una disolucin saturada de sal comn (NaCl) donde una parte importante de las molculas de agua participa en la solvatacin de los iones de la sal disuelta. En este ltimo caso, la actividad de agua mucho menor que en el primero. conforme aw 1.00 ambiente bacterias hongos agua de mar, sangre mayora Gram- no halfilas verdura, fruta, carne 0.95 pan 0.90 0.85 0.80 0.75 jamn salames mayora de bacilos Gram+ mayora de cocos Bacillus Staphylococcus basidiomycetes Fusarium, Mucor Rhizopus Saccharomyces rouxii conservas lagos salados pescado salado Halobacterium Actinospora Penicillum Aspergillus 0.70 cereales, dulces 0.60 chocolate, miel Aspergillus Saccharomyces rouxii Xeromyces bisporus leche desidratada 0.55- alteracin del ADN El patrn cintico de una fermentacin puede comportarse de tres tipos diferentes (Gden, 1959): Metabolitos tipo I Metabolitos tipo III Metabolitos tipo II Son aquellos que se producen durante el periodo de crecimiento exponencial del cultivo. Se producen durante la fase estacionaria. Situacin mixta Clasificacin de Gaden de la produccin en cultivo por lotes El comportamiento del crecimiento microbiano puede predecirse mediante modelos matemticos, que permiten estudiar el comportamientos y simular el efecto de variar las condiciones de operacin dentro de su rango de validez. Estos modelos pueden tener base experimental, terica o mixta. En la actualidad se favorecen los modelos con bases tericas. (Cabe recordar el modelo de Monod con base emprica, ya que es uno de los mas empleados en cintica de crecimiento). Modelos estructurados Consideran el funcionamiento interno de la clula, la cual se supone internamente compartimentalizada o estructurada segn las funciones a cumplir. Estos modelos incluyen la sntesis de protenas y cidos nucleicos y los mecanismos de regulacin metablica. Modelos no estructurados Representan el comportamiento promedio de poblaciones de clulas a trabes de la cuantificacin de propiedades del cultivo: concentracin de biomasa, producto y sustrato, velocidades de crecimiento y produccin. Estos modelos son ms simples y contienen un nmero menor de constantes, por lo que se les utiliza como primera alternativa. Modelo de Luedeking y Piret, propuesto para la produccin de acido lctico por lotes, uno de los pocos modelos no estructurados que cumplen los requisitos bsicos de un buen modelo: simpleza y generalidad. dP dt dX dt Ecuacin 33 X qP 1 dP X dt Ecuacin 34 Este modelo ha sido aplicado con xito a fermentaciones de muy distintas caractersticas: metabolitos primarios y secundarios, cultivos de bacterias y hongos, por lotes y continuos. Su generalidad tal vez se deba a que contienen un trmino asociado al crecimiento y otro no asociado, por lo que puede representar bien distintas situaciones segn sean los valores relativos de y . Para ilustrar los modelos estructurados citaremos el modelo de Dean, que trata al metabolismo como una red cerrada de reacciones entre las cuales no es posible individualizar un lmite. El caso ms simple de red es una sucesin de dos reacciones en las que el primer reactante Y es generado por el segundo Z. se puede escribir dY dt K1 Z Ecuacin 35 dZ dt K2Z Ecuacin 36 K1 y K2, constantes cinticas del modelo de Dean. Estas ecuaciones pueden formularse para n componentes y permiten predecir una serie de propiedades, como son el crecimiento exponencial, el crecimiento balanceado, el carcter oscilatorio de los sistemas biolgicos, el requerimiento de un inoculo en pleno crecimiento y otras. 4. Balance de Materia Sistema: consiste en cualquier materia identificada para su investigacin. Un sistema es afectado por un proceso o por sus alrededores. Ley de la conservacin de Masa La masa es conservada en procesos qumicos y fsicos ordinarios. Si tenemos un sistema continuo con alimentacin y descarga conteniendo glucosa una velocidad de flujo de masa : M i y M o (Kg/h) Diagrama de balance de masa en un sistema de operacin continua La diferencia entre M y M puede ser debido al consumo o generacin por reacciones, y/o acumulacin. Un balance de masa del sistema puede representarse como sigue: o i masa que entra masa que sale masa generada Ecuacin 37 masa consumida masa acumulada Ecuacin general de balance de masa En un sistema en equilibrio: masa que entra masa generada masa que sale masa consumida Ecuacin 38 Ecuacin general de balance de masa en un sistema en equilibrio Como las especies atmicas como C, N y O no pueden ser consumidas o generadas en reacciones qumicas en este tipo de sistemas, el equilibrio en este sistema determinado por el balance total de masa o de las especies atmicas. Esto es: masa que entra masa que sale Ecuacin 39 Un balance de materia debe realizarse de manera organizada: 1. 2. 3. 4. 5. Esquematizar claramente el proceso mediante un diagrama de flujo, mostrando la informacin mas relevante. Seleccionar las unidades y expresarlas claramente. Seleccionar una base de clculo y expresarla claramente Manifestar todas las suposiciones que debern ser consideradas en el problema. Identificar que componentes del sistema que este involucrado en la reaccin, si ste es el caso. Ejercicio 4: Aire hmedo enriquecido con oxgeno es preparado para la fermentacin cido glucnico. El rie es preparado en un humidificador especial. 1.5 L/h de agua entra al humidificador al mismo tiempo que entra aire seco y 15 gmol/min de oxgeno. Tota el agua que entra es evaporada. El flujo de salid del gas contiene 1% (m/m) de agua. Dibuja el diagrama para este proceso. 5. Balance de Energa La ley de la conservacin de la energa dice que el balance de energa en un sistema puede es realizado para determinar la cantidad de calor requerida para mantener la temperatura de un proceso. La energa adquiere tres formas Energa cintica (Ek): sistema en movimiento Energa potencial (Ap): sistema en campo gravitacional o electromagntico Energa interna (U): suma de la energa de las molculas, partculas atmicas y sub-atmicas de la materia. La energa puede ser transmitida de dos formas: Calor, energa que fluye a travs de los sistemas debido a la diferencia de temperaturas que existe entre el sistema y sus alrededores. Trabajo, energa transferida como resultado de la aplicacin de una fuerza motriz, menos el calor. Puntual (Ws), trabajo realizado por algn elemento en movimiento del sistema (mezclador en un fermentador) Flujo (Wf), energa requerida para Ecuacin 40 p, presin desplazar la materia en unpV sistema. W f V, volumen Ecuacin general de Balance de energa Recordemos que el principio de un balance es la ley de conservacin Ecuacin 41 Ws energa que entra al sistema energa que sale del sistema energa acumulada en el sistema Esto es asumiendo que el sistema es homogneo y sin efectos de otras energas Mi Mo Q Para aplicar la ecuacin 41, debemos identificar primero las formas de energa que estn involucradas en cada trmino de la expresin, por tanto: M i (u ek ep pv)i M o (u ek ep pv)o Q Ws E Ecuacin 42 Refirindonos a un proceso con un solo flujo de entrada y salida Mi, masa que entra al sistema Mo, masa que sale del sistema E, energa total del sistema u, energa interna especfica ek, energa cintica especfica ep, energa potencial especfica p, presin v, volumen especfico Q, Calor Ws, trabajo puntual Una ecuacin general en participan n nmero de flujos: M (u ek entrada donde ep pv) M (u ek salida ep pv) Q Ws E Ecuacin 43 Considerando que h=u+pv, (entalpa especfica) M (h ek entrada ep ) M (h ek salida e p ) Q Ws E Ecuacin 44 6. Descripcin y tipos de Biorreactores Geometra del reactor Componentes bsicos un fermentador de El recipiente debe ser esterilizable resistente a la corrosin construido con materiales que no sean txicos vidrio de espesor apropiado acero inoxidable Entrada/salida de aire o gases Entrada del medio de cultivo y salida del producto obtenido Alimentacin del inculo Lneas de muestreo Sistemas de agitacin mecnica Clasificacin operativa Por lotes Semicontinuo Continuo Clasificacin biolgica Anaerobio Facultativo Aerobio Medicin y regulacin El panel de control consiste en un pantalla LCD (visualizador de cristal lquido) y botones de control. Todos los parmetros (temperatura, pH, pO2, flujo de aire, agitacin y otros parmetros adicionales como: pCO2, densidad ptica, antiespumante, etc.) son claramente visibles en la amplia pantalla. Los controles deben ser simples y lgicos. Cada fermentador puede ser operado de manera autnoma o conectado a un PC (a travs del puerto serial RS 485 integrado en el fermentador). Con los programas de fermentacin (SIAM o FNet, desarrollado especialmente para el fermentador LAMBDA MINIFOR) es posible controlar y procesar casi ilimitadamente los datos de varios fermentadores en paralelo. Recipiente Un recipiente puede estar compuesto de un frasco de fermentacin (volumen de 35 ml - 4.5 l). Los recipientes pueden ser fabricados en un vidrio Pyrex de alta calidad, acero inoxidable u otro material inocuo. Debe contar con una amplia entrada principal y para el montaje de los diferentes componentes: puede poseer entre 6 y 8 compartimentos para la fijacin de diferentes sensores, salida de aire, Agitacin La agitacin de un sistema es necesaria para la dispersin del sistema y aireacin del mismo. La agitacin mecnica con ayuda de aspas y motor que produzca su giro es lo mas comn. Esta operacin requiere de un consumo alto de energa por unidad de volumen. Existen equipos que utilizan un nuevo sistema vibrador. Un potente electroimn mueve uno o varios discos perforados hacia arriba y hacia abajo. La principal ventaja es una mezcla eficiente y una aireacin del medio de cultivo. Mantiene el interior del frasco totalmente aislado del exterior mediante una membrana de silicona de bajo costo. No se necesitan baffles (deflectores). Este tipo de agitacin es, a su vez, ms suave con las clulas y evita la formacin de vrtices y de espuma. La frecuencia de vibracin es controlada por un microprocesador y puede ser variada dentro de un amplio rango. La entrada de aire se efecta a travs de varios capilares fijados en el disco inferior. Sin embargo su aplicacin a gran escala, es difcil por su gran costo. Parmetros de control Temperatura, contempla comnmente sistemas de enchaquetados o calentadores directos. O2, Un electrodo esterilizable mide la concentracin del oxigeno disuelto. pH, la medicin de pH se hace por medio de un electrodo esterilizable que se combina con un sensor de temperatura. Entrada y salida de aire El flujo de entrada/salida de aire puede ser programado segn sus requerimientos mediante el uso de un vlvulas y medidores de flujo para gas. La medicin deber ser independiente de la variacin de presin y temperatura del aire. Es importante destacar que tanto el aire que entra como el que sale del sistema, deber estar en condiciones de Incubacin y toma de muestra La inoculacin, adicin de cido o base y toma de muestras se realiza a travs de compartimentos independientes, equipados con adaptadores o conectores de cierre hermtico. Se realiza comnmente con bombas peristlticas que permitan manejar los gases en condiciones estriles y con flujos independientes. Control de flujo de gases. Consideraciones especiales en seleccin de un fermentador: 1. el diseo y 2. 3. El envase o contenedor en donde se realizar la fermentacin debe ser capaz de ser operado aspticamente durante el tiempo en que la operacin se realice. Esto es de vital importancia en procesos continuos. La aereacin (o ausencia de esta) y la agitacin deben realizarse de forma que se cumplan con los requerimientos metablicos del microorganismo utilizado. El mezclado debe hacerse de forma que los nutrientes estn uniformemente distribuidos en el fermentador sin que esto conlleve dao fsico al microorganismo. El aire debe estar filtrado para evitar la entrada de microorganismos en el polvo. El consumo de energa debe ser tan bajo como sea posible. 4. 5. 6. Un sistema de control de temperatura debe ser provisto en prcticamente todas las operaciones controladas. La temperatura es un factor sumamente importante en todos los procesos de fermentacin. Un sistema de control de pH debe ser provisto en la gran mayora de las operaciones. En muchos casos, solo se requiere de un ajuste inicial de pH. Sin embargo, en medios que no tengan efectos amortiguadores, el control de pH es muy importante, en especial si pequeas variaciones de pH afectan adversamente al microorganismo. El fermentador debe proveer algn tipo de sistema para un muestreo eficiente y que no promueva la contaminacin del proceso 7. 8. 9. 10. Las perdidas por evaporacin deben ser mnimas. El diseo del envase (o tanque) debe considerar un fcil manejo para las operaciones de limpieza y mantenimiento. Las paredes del envase (o tanque) deben ser pulidas, es decir, no deben tener porosidad que dificulte la limpieza y sanitizacin. Los materiales de construccin deben ser resistentes a los compuestos que se generen durante el proceso y a la materia prima, sales, cidos o bases que se aadan. Adems deben ser materiales que no interfieran con las enzimas de los microorganismos que se utilicen. Usualmente los fermentadores se construyen de vidrio (en el caso de fermentadores de laboratorio) o de acero inoxidable. En el caso de fermentadores industriales que se instalarn basados en pruebas de planta piloto, se recomienda el uso de envases con la misma forma (o geometra). ...
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This note was uploaded on 08/27/2008 for the course BIO 102 taught by Professor Lara during the Spring '08 term at Trenholm TC.

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