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BiotecPrac2006CineticaEnzimas(2008) - CINTICA ENZIMTICA...

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CINÉTICA ENZIMÁTICA – ESTUDOS DE VELOCIDADE INICIAL Trabalhe em pares – use o mesmo número da enzima que vocês usaram na semana passada para a purificação de proteínas Objetivos demonstrar como estudos clássicos de cinética enzimática são feitos determinar o K M e k cat da enzima fosfatase alcalina ( virtual ) Aprender fazer os cálculos corretamente e cuidadosamente (incluindo o tratamento correto de unidades)! Introdução Muitas enzimas (mas não necessariamente todas) mostram cinéticas de Michaelis-Menten Para a reação S P o M o T cat 0 0 o [S] K [S] [E] k dt d[P] dt d[S] v + = = - = onde v o = velocidade inicial da reação (mol substrato convertido L -1 min -1 ) [E] T = concentração total de enzima adicionada (vai existir em duas formas na solução - enzima livre e enzima complexada com substrato) (as unidades podem ser mg-enzima L -1 ) k cat = constante catalítica (mol substrato convertido mg-enzima -1 min -1 ) [S] o = concentração inicial do substrato (mol L -1 ) K M = constante de Michaelis-Menten (mol L -1 ) (outras unidades podem ser usadas – desde que a equação seja dimensionalmente correta!) Os termos expressos como diferenciais são para o caso em que 1S 1P e mostram que dá para seguir a reação ou medindo a diminuição na concentração do substrato ou medindo o aumento na concentração do produto. Muitas vezes a concentração da enzima não é conhecida, e a equação fica o M o max o [S] K [S] V v + = onde V max = k cat [E] T = velocidade máxima que pode ser alcançada com aquele concentração da enzima (mol substrato convertido L -1 min -1 ) Os estudos clássicos da cinética enzimática envolvem a determinação dos parâmetros K M e k cat . Nesta prática, nós determinaremos K M e k cat para a hidrólise do substrato p -nitrofenilfosfato pela enzima fosfatase alcalina. A reação é assim: O p -nitrofenolato absorve luz maximamente a 405 nm, com um coeficiente de extinção de 16900 L mol -1 cm -1 . Note-se que para -nitrofenolato irrita a pele: lave as mãos bem se você tocar a solução. Lave as mãos bem no fim do experimento. O 2 N O P OH O O O P OH O O O 2 N O p -nitrofenilfosfato ( p NPP - sem cor) fosfatase alcalina a pH 8,0 + p -nitrofenolato (amarelo) + H 2 O fosfato
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Estudos clássicos de cinética enzimática Efeito da concentração da enzima A equação de Michaelis-Menten é de primeira ordem em [E] T . Mantendo [S] o constante e variando a concentração total de enzima, devemos obter os seguintes resultados (no caso de medir a concentração do substrato): O QUE VOCÊS VÃO FAZER 1. Ensaios* Número do ensaio E1 E2 E3 E4 E5 E6 [ p -nitrofenilfosfato] ( μ M) 5000 5000 5000 5000 5000 5000 [Enzima] (mg L -1 ) 5 15 25 50 75 100 Se for necessário, pode fazer outros ensaios – tome cuidado com os volumes! Se, por qualquer razão, você precisar usar o ponto decimal, use “.”e não “,”(ou seja, use "ponto" e não "vírgula)! v
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This note was uploaded on 10/11/2008 for the course ENGEENER 222 taught by Professor Ku during the Spring '03 term at York UK.

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