MONOGRAFIAAA ENZIMOO FSIIIII.docx - 1 Mu00c9TODOS DE...

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1.MÉTODOS DE PURIFICACIÓN ENZIMÁTICAa)Cromatografía de afinidad La cromatografía se utiliza para separar las enzimas dependiendo de la diferencia de sus cargas,tamaño o afinidad de estas. Las proteínas tienen la capacidad de unirse específicamente a ciertasmoléculas mediante uniones fuertes, pero no covalentes. [ CITATION Cer09 \l 2058 ]El ligando es la molécula que se une específicamente a la proteína y a la vez se unecovalentemente con una matriz inerte. Al realizar la técnica se aplica a la columna el extracto conla mezcla de la proteína, esta se unirá al ligando inmovilizado lo que retardará su migraciónmientras que las demás saldrán de la columna con el tampón. [ CITATION Ite07 \l 2058 ]b)Cromatografía por cambio iónicoEn la cromatografía de intercambio iónico, la retención se basa en la atracción electrostática entrelos iones en solución y las cargas inmovilizadas en la fase estacionaria. Los iones de la misma cargade la resina contenida en la columna son excluidos, mientras que los que tienen carga opuestaquedan retenidos, las proteínas más cargadas se unirán más fuertemente al intercambiador y porlo tanto serán más difíciles de eluir. El distinto comportamiento iónico que presentan las proteínasexpuestas a diferentes pH, permiten su separación diferencial cromatográficamente. La carga netade las proteínas varía con el pH en que se encuentran, siendo ésta nula en el denominado puntoisoeléctrico. [ CITATION Ite07 \l 2058 ]La afinidad con la que una proteína se une a un intercambiador iónico depende de la fuerza iónicadel medio, debido a la competencia entre los grupos cargados de la proteína y los iones de la fasemóvil. [ CITATION Cer09 \l 2058 ]c)Cromatografía de exclusión molecular o filtración en gelLa fase estacionaria es la sustancia que está fija en una posición en el procedimiento de lacromatografía y está constituida por partículas de polímeros de diferente porosidad (de estaporosidad dependerá la entrada de proteínas de un cierto peso molecular). Esta separación se basaen el tamaño de las partículas. Son eluidas con más rapidez las proteínas grandes que no puedenpenetrar los poros de la matriz mientras que las proteínas pequeñas que si lo logran siguen unlargo camino. [ CITATION Ite07 \l 2058 ]Generalmente se trata de una cromatografía de baja resolución de forma que se suele utilizar enlos pasos finales del proceso de purificación. También es muy útil para la determinación de laestructura terciaria y cuaternaria de las proteínas purificadas. [ CITATION Uni09 \l 2058 ]d)Cromatografía hidrofóbicaLa fase estacionaria es apolar (hidrofóbica), es decir, la proteína se pega al soporte por los resto deaminoácidos apolares, cuanto más residuos de este tipo tenga en su superficie, más apolar será,más se retendrá en la columna y se eluirá más tarde. En este caso a elusión se realiza aumentandola apolaridad de fase móvil.
Métodos de Extracción, purificación e inmovilización enzimáticaENZIMOLOGÍAe)

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