Practica 4 - PRACTICA 4 DOT BLOT INTRODUCCION Las transferencias de puntos son muy similares a las transferencias de Western en que implican el uso de

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PRACTICA 4.- DOT BLOT. INTRODUCCION: Las transferencias de puntos son muy similares a las transferencias de Western en que implican el uso de anticuerpos para identificar una proteína que se ha unido a una membrana. Sin embargo, no requieren separación electroforética de proteínas en un gel ya que la muestra de prueba simplemente se observa en la membrana y luego se detecta. Debido a la falta de una etapa de separación de proteínas, las transferencias de puntos no pueden usarse para determinar el peso molecular de una proteína o para discriminar entre diferentes formas de proteínas (por ejemplo, proteínas escindidas o fosforiladas). En cambio, las transferencias de puntos son convenientes para estimar la concentración de proteínas en preparaciones crudas, como sobrenadante de cultivo de tejidos o ascitis, para determinar si un sistema de detección basado en anticuerpos funcionará de manera efectiva o para identificar una concentración de anticuerpos adecuada para la transferencia Western. Los pasos principales de un ensayo tradicional de Dot Blot son los siguientes: 1. La proteína se ve en una membrana de nitrocelulosa o PVDF, por ejemplo, usando una pipeta de bajo volumen o una herramienta de pin 2. La membrana está bloqueada 3. Incubación con anticuerpo primario 4. La membrana se lava para eliminar el anticuerpo no unido 5. Incubación con anticuerpo secundario 6. La membrana se lava para eliminar el anticuerpo no unido 7. Detección: generalmente colorimétrica, fluorométrica, quimioluminiscente o con nanopartículas de oro.
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  • Spring '16

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