PCR 기초강좌 16 - PCR을 ì&acu

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1 No.17 Life Science & Biotechnology PCR PCR 기초강좌 16 PCR을 이용한 미지 영역의 Cloning I H. Nakayama 그림 1 lane 1 : 최초의 PCR(SP와 AP1로 증폭) lane 2 : Sense, antisense 두 종류의 primer를 이용한 nested PCR(SP와 AP2로 증폭) lane 3 : Sense primer(SP) control lane 4 : Antisense primer(AP2) control 비특이적 증폭은 흔히 한쪽의 primer만으로 증폭이 일어나는 경우이며, lane 3, 4와 같이 한쪽 primer만을 포함하는 negative control의 PCR을 통하여 목적 밴드가 양쪽의 primer에서 증폭 된 것을 확인한다. PCR은 기지서열의 일부를 primer로 제작하여 primer의 특이성으로 primer 사이의 영역을 증폭하는 방법이다. PCR은 기지유전자의 cloning에 널리 이용하고 있으며 미지유전자의 cloning을 위한 여러 가지 방법이 고안되어 실용화되고 있다. 대표적인 미지 유전자의 cloning 방법으로 1)3’ -RACE법, 2)Degenerate PCR법, 3)AP-PCR법과 DD법, 4)5’ -RACE법 등이 있다. 본 고에서는 미지의 유전자를 cloning하는 기본적인 원리와 3’ -RACE, degenerate 법, DD법의 원리와 주의점에 대하여 소개한다. 다음 호(Life Science & Biotecnology 18호, 2001년 3월 1일 발간 예 정)에는 5’ -RACE법을 중심으로한 미지 유전자 cloning법에 대해 소개할 예정이다. 1. 일반적인주의사항 1.1 Negative control를 만든다. 미지유전자의 cloning을 위한 PCR 대부분은 특정유전자를 증폭하는 PCR보다 특이성이 낮아 비특이적 증폭이 많이 일어난다. 비특이적 증폭에서 특이적 증폭만을 구별하는 간단한 방법은 없지만 특이적 증폭이 아닌 것을 알 수 있는 방법 있다. 즉 한쪽의 primer만으로 증폭되는 것은 비특이적 증폭이다. RACE법이나 degenerate PCR법을 이용하여 미지 유전자를 분리하기 위해서는 반드시 양쪽의 primer 중 한쪽만을 포함하는 negative control을 두 종류 만들어 동시에 증폭하여 전기영동으로 비교해야 한다. 한쪽의 primer로 증폭이 되는 것은 비특이적 산물이며 negative control 실험은 특이적 산물을 선택할 있는 가장 간단한 방법이다. 흔히 PCR로 증폭산물을 subcloning하고 sequencing으로 확인하는데, sequencing 단계에서 양쪽에 같은 primer가 있음을 확인하면 처음부터 모든 실험을 다시 시작해야 하는 오류를 범하게 된다. 그림 1과 같이 lane 3, 4는 lane 2에 대한 negative control로 한쪽 primer만을 사용하였다. 그림 1 왼쪽의 화살표로 표시된 분자량이 밴드는 lane 2 뿐만 아니라 lane 3에서도 증폭됨을 있다. 다행히 목적 산물(110 bp)이 lane 2에서만 확인되었지만 만약 목적 산물의 크기가 화살표 위치였다면 그것을 cloning하여도 양쪽 끝에 같은 primer를 갖는 부분만 얻게 된다.
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