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No.18 Life Science & Biotechnology 17 17 PCR PCR 기초강좌 17 PCR을 이용한 미지 영역의 Cloning II H. Nakayama PCR은 기지서열의 일부를 primer로 제작하여 primer의 특이 성으로 primer 사이의 영역을 증폭하는 방법이다. PCR은 지유전자의 cloning에 널리 이용하고 있으며 미지유전자의 cloning을 위한 여러 가지 방법이 고안되어 실용화되고 있다. 대표적인 미지 유전자의 cloning 방법으로 1)3’ -RACE법, 2)Degenerate PCR법, 3)AP-PCR법과 DD법, 4)5’ -RACE법 등 있다. 지난 호에서는 미지 영역을 cloning하는 기본적인 원 리와 3’ -RACE, degenerate법, DD법의 원리와 주의점에 대하 소개하였다. 이번 호에는 5’ -RACE법을 중심으로한 미지 영역 cloning법에 대해 소개한다. 1. 5’ -RACE법 1-1 5’ -RACE법의 원리 1-1-1 TdT를 사용한 5’ -RACE법 5’ -RACE는 mRNA의 서열의 일부를 알고 있을 때 5’상류 미지영역을 cloning하기 위한 방법이다. 그림 1에 5’ - RACE법의 원리도를 나타내었다. 우선 상류의 미지영역을 찾기 위해서 기지 서열을 토대로 한 특수 유전자인 anti- sense primer(GSP1)를 이용하여 역전사 반응을 한다. 그 cDNA와 두가닥을 이루고 있는 mRNA를 RNaseH로 분해하 가닥의 1st strand cDNA를 만든다. 이 DNA는 5’말단 에 GSP1의 서열을 가지고 3’말단에는 미지서열을 갖고 있 다. 이 미지서열을 PCR로 증폭하기 위해서 1st strand cDNA 3’말단에 anchor서열을 부가해야 한다. 보통 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)로 nucleotide homopolymer를 anchor서열로 부가한다. Anchor서열을 부가한 후 anchor서열 3’말단에 상보적인 nucleotide polymer를 갖는 adaptor primer인 anti-sense primer(GSP2* 1 )를 사용하여 nested PCR로 5’하류 미지영역을 포함하는 cDNA를 증폭한다. *1 이때 유전자 특이적 primer인 GSP1을 사용하면 anti-sense primer를 사용하는 경우 보다 비특이적 증폭이 일어나기 쉽기 때문에 GSP2를 보다 상류측에 design하고 nested PCR하는 것이 좋다. 그림 1 5’ -RACE법에 의한 미지 영역의 cloning 미지의 5’상류서열을 포함하는 산물 표적 mRNA 미지영역 기지영역 역전사 반응 RNA분해(RNase H) cDNA의 3말단에 anchor서열(dC polymer)을 부가한다(TdT) dG polymr가 붙은 adaptor primer와 GSP2로 nested PCR 한다. dG polymer가 붙은 adaptor primer 유전자특이적 서열을 mRNA에 annealing한다.
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PCR PCR 기초강좌 17 18 No.18 Life Science & Biotechnology 18 1-1-2 RNA ligase를 사용한 5’ -RACE법 한가닥 핵산을 ligation 시키는 RNA ligase로 한가닥 oligonucleotide adaptor를 ligation하여 1st strand cDNA를 정제 하는 방법이다.
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What students are saying

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