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AP PCR SSCP법에 의한 암유전&igr

AP PCR SSCP법에 의한 암유전&igr

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±응용편 PCR-SSCP법에의한 암유전자해석 >>162 Ⅰ. AP-PCR-SSCP법에 의한 암 DNA 해석 Ⅱ. 비방사성 표식 PCR-SSCP에 의한 암 DNA의 임상검사
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PCR-SSCP법에 의한 암 유전자 해석 >>163 Ⅰ. AP-PCR-SSCP법에 의한 암 DNA 해석 발암 기작을 연구하는 한 방법으로서 흔히 암 세포 genome상에 존재하는 DNA의 결실 유무를 검사하며, 현 재까지 많은 암 관련 유전자 특히 암 억제 유전자의 동정에 매우 중요한 역할을 하였다. 대표적인 암 억제유전자로 p53 유전자와 RB 유전자가 있으나 암세포의 이상 출현빈 도는 종양의 종류 및 암 진행도에 따라 큰 차이가 있으며, 여러 종류의 세포에서 발암 기작을 공통적으로 설명하기에 는 부족하다. Human 간암세포(hepatocellular carcinoma; HCC)의 예를 들면 진행중인 암은 일정 빈도의 loss of heterozygosity(LOH) 및 유전자 내의 염기치환 등 DNA 이상 1~4) 이 확인되지만, 조 기암인 경우 일부 LOH의 보고를 제외하고 이상은 검출되 지 않는다 1) . 이 기지 유전자좌에서 암부위 특이적 이상의 검출은 기존의 많은 검사법으로 쉽게 검출하고 있으나 기 지유전자의 해석에서 얻을 수 있는 정보는 극히 제한적이 다. 이러한 견지에서 암세포 genome 미지영역에서 DNA 이상의 광범위한 검색은 매우 중요하다. Welsh 팀에서 개발한 arbitrarily primed-polymerase chain reaction (AP-PCR) 6) 법은 검색 대상 DNA 영역의 염기서열 정보없이 human cancer DNA 해석에 이용할 있다. 즉 DNA mismatch 수복 기작의 이상 (replication error; RER)으로 미지영역의 단순 반복서열 수의 변화 검출 7) , genome상의 염기서열 결실이나 증폭 등 이상의 검출 8, 9) 에 이용된다. 본 고에서는 AP-PCR로 생성된 DNA 단편의 single- strand conformation polymorphism(SSCP)을 해석 10, 11) 하는 AP-PCR-SSCP법에 의한 DNA 이상 검사에 대하여 소개한다. 1. AP-PCR 원리 그림 1에 AP-PCR의 원리를 나타내었다. 한개의 primer 를 이용하여 낮은 온도·장시간의 annealing 조건에서 PCR하면 primer와 주형 DNA의 염기서열간에 다소 mismatch가 존재하여도 annealing이 형성되어 DNA 합 성이 시작된다. 이 조건에서 1~수 cycle의 PCR(low stringency PCR)을 한다. 이렇게 생성된 DNA단편을 주 형으로 같은 primer를 사용하여 높은 온도·단시간 annealing 조건에서 30-40 cycle PCR(high stringency PCR)한다. 이 결과 같은 primer 염기서열로 좁혀진 수 십 개의 DNA 단편을 genome상의 다양한 위치에서 증폭할 수 있다. 2. AP-PCR Human 암 조직 및 정상조직에서 DNA을 proteinase K- phenol chloroform법 12) 으로 추출하여 주형으로 사용한다.
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