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PCR 기초강좌10 - RNA 에 의&ia

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Life Science & Biotechnology No.11 2 ± 그림 1 GMS 417 Arrayer TM Spotting bed에 독자적인 spotting 방식(Pin&Ring법)을 채용한 arrayer이다. 다른 spotting방식 비교하여 spot size를 아주 정확하게 조절할 수 있어 고밀도의 chip을 제작할 수 있다. ± 발현해석 (1) GMS system의 평가 유전자 발현을 해석하는 경우 대상 시료와 대조 시료를 각각 다른 형광물질로 표식하여 동일한 DNA chip상에서 hybridization한 후 각각의 형광을 검출함으로써 발현량의 비 율을 조사한다. 정확한 검출을 위해서는 각 형광물질양의 비 율이 그대로 발현량의 비율로 반영되는 것이 대전제이다. 만 약 어느 한쪽의 형광물질이 강하게 검출되어 버리면 정확한 발현량의 비율을 얻을 없다. 따라서 GMS system이 발현 량의 차이를 정확하게 검출할 수 있는지를 시험해 보았다. [실험방법] 우선 형광기질 analogue Cy3 TM -dUTP와 Cy5 TM -dUTP를 그 3에 나타낸 비율로 혼합하여 GMS 417 Arrayer TM 을 이용 하여 slide glass에 spotting한 GMS 418 Array Scanner TM scanning하였다(scanning 파장 : Cy3 TM -dUTP : 532 nm, Cy5 TM -dUTP : 635 nm). 그 다음 spot 내의 각각의 형광 시그널의 강도를 해석 소프트웨어 [ImaGene TM ]을 사용하여 측정하여 그 비율을 계산하였다. 그림 2 GMS 418 Array Scanner TM Scanning bed에 독자적인 scanning 방식(Flying Objective Microscope)을 채용한 confocal laser scanner이다. 이 방식으로 다른 scanner보다 압도적인 고속으로 scanning 할 수 있다 (약 3분/slide glass 전면). 그림 3 Cy3 TM 과 Cy5 TM 의 혼합비 100 nM 100 nM Cy3 TM -dUTP Cy5 TM -dUTP 1 : 9 2 : 8 3 : 7 4 : 6 5 : 5 6 : 4 7 : 3 8 : 2 9 : 1
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Life Science & Biotechnology No.11 3 (2) DNA minichip을 이용한 발현해석 [실험방법] 사람 유전자 80종류를 RT-PCR로 증폭(각각 700 bp)하 GMS 417 Arrayer TM 이용하여 slide glass에 spot(spot size : 직경 150 ㎛)한 고정화 처리하여 DNA minichip을 제작 하였다. 배양세포 MKN1의 mRNA 2 ㎍을 AMV RTase XL 로 역전사반응을 실시하여 Cy3 TM -dUTP로 표식하였다. 동일 방법으로 배양세포 NUGC4의 mRNA 2 ㎍을 역전사반응 후 Cy5 TM 으로 표식하였다. 이 2개의 시료를 혼합하여 DNA minichip에 hybridization시켜 GMS 418 Array Scanner TM scanning하였다. 해석용 소프트웨어 [ImaGene TM ]을 사용하여 scanning data를 해석하였다. [결과] Scanning 결과를 그림 5에, 해석결과를 그림 6에 나타내었 다. GMS 418 Array Scanner TM 에 부속되어 있는 해석 소프트 웨어 [ImaGene TM ](TaKaRa code BD001)은 DNA chip 실험에 서 얻은 2개의 data를 취합하여 각 spot의 시그널 강도를 자 동측정하고 해석결과를 Scatter Plot이나 원그래프로 표시해 준다.
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