91_GuiaTPBiologia_Guia TP Biolog\u00eda II 1ro 2018.pdf - Biolog\u00eda II \u2013 1er Cuatrimestre 2018 Trabajo Pr\u00e1ctico N\u00b0 9 Electroforesis Evaluaci\u00f3n del ADNg

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Biología II 1 er Cuatrimestre 2018 91 Trabajo Práctico N° 9 Electroforesis: Evaluación del ADNg en geles de agarosa ELECTROFORESIS: Geles de Agarosa En una separación electroforética, las partículas cargadas, migran en un medio determinado con dirección al electrodo de signo opuesto. Esto ocurre bajo la influencia de un campo eléctrico externo aplicado en una corrida electroforética. Los movimientos de las partículas son retardados por la interacción con una matriz sólida, porosa e inerte en la que están inmersas, la cual actúa como un tamiz. Todo este fenómeno se lleva a cabo a su vez en un medio acuoso (buffer) con iones que transmiten la corriente eléctrica. La resultante de la interacción eléctrica y del tamiz molecular resulta en una velocidad de migración diferencial que permite separar los componentes de una mezcla de macromoléculas (tanto ácidos nucleicos como proteínas), basándose en el tamaño, forma y carga neta de las macromoléculas. Una electroforesis puede realizarse en geles de agarosa o en geles de poliacrilamida dependiendo del material a resolver. La agarosa es un polímero lineal de hidratos de carbono, extraído de un alga marina, los geles se preparan fundiendo la agarosa en el buffer elegido. Los geles de poliacrilamida se generan por la polimerización de la acrilamida y la bis-acrilamida mediada por un catalizador. Ambos métodos son utilizados para la separación, identificación y purificación de fragmentos de ADN. En el caso de los geles de poliacrilamida también se utilizan para separar o resolver proteínas a partir de un extracto celular (mezcla de proteínas). La técnica es simple y rápida de realizar, es capaz de resolver fragmentos de ADN que no pueden separarse por otros métodos. Además, la localización del ADN dentro del gel puede determinarse directamente mediante tinciones con bajas concentraciones de un colorante fluorescente intercalar, llamado: Bromuro de Etidio (BrEt). Así, las bandas que contengan tan solo de 1 a 10 ng de ADN podrán ser visualizadas por examen directo del gel bajo luz ultravioleta. Si resulta necesario, las bandas pueden recuperarse del gel para ser utilizadas posteriormente con otros propósitos. Los geles pueden confeccionarse de varias formas, tamaños y porosidad, y pueden correr horizontales los agarosa y verticales los de poliacrilamida, en un campo eléctrico de fuerza y dirección constante. La elección dentro de estos parámetros depende principalmente del tamaño de los fragmentos que se desean separar. Los geles de poliacrilamida son más efectivos para separar fragmentos pequeños de ADN (5 a 500 pb), y su poder de resolución es extremadamente grande, pudiendo separar fragmentos que difieren en 1 pb. Los geles de agarosa, poseen un poder resolutivo menor respecto de los geles de poliacrilamida, pero poseen un rango mayor de separación. Mediante concentraciones variables de agarosa, se pueden separar fragmentos de ADN desde 200 pb hasta aproximadamente 50 kb de longitud.
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