Lecture 2

Lecture 2 - Lecture2 3.3.WorkingwithProteins

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Lecture 2 3.3. Working with Proteins Proteins separated by properties: size, charge, binding properties  First step is to break open cells and release protein into solution:  crude extract  Differential centrifugation can prepare subcellular fractions or isolate specific  organelles  Fractionation techniques o Differences in solubility (function of pH), temp, salt conc o Solubility of proteins is lowered at high salt concentrations  o Addition of certain salts in the right amount can precipitate some proteins  (ammonium sulfate is effective) o Dialysis:  separates proteins from solvents using protein’s larger size:  extract is placed in bag/tube of semipermeable membrane, suspended in  larger volume of buffered solution of ionic strength, membrane exchanges  salt and buffer but not protein Column chromatography:  charge, size, binding affinity - A porous solid material (stationary phase) is held in columm - A buffered solution (mobile phase) percolates through it - Protein-containing solution, layered on top, percolates through  solid matrix as every-expanding band within the larger mobile  phase - Individual proteins migrate faster or more slowly through column  depending on properties Cation-exchange chromatography:  solid matrix has negatively charged  groups; in mobile phase, proteins with net positive charge migrate through  more slowly o Column matrix containing anionic groups are  cation exchangers;  those with cationic groups are  anion exchangers Size-exclusion chromatography  separates proteins based on size; large  proteins emerge sooner than small ones; solid phase has beads with  pores/cavities of particular size; large proteins do not enter while small enter  cavity and migrate down column slower Affinity chromatography:  beads in column have attached chemical group  to which a protein has affinity for; protein binds to beads in column HPLC (high-performance liquid chromatography):  high pressure pumps  speed movement of proteins molecules down column; by reducing the  transit time, it limits diffusional spreading of protein bands and thus  improves resolution Electrophoresis - migration of charged proteins in an electric field; not generally used to  purify proteins in large amounts
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Lecture 2 - advantage: proteins can be visualized and separated; to estimate the number  off different proteins in mixture/degree of purity; to determine isoelectric  point and approximate molecular weight - carried out in gels made of cross-linked polymer  polyacrylamide:  slows the  migration of proteins approximately in proportion to charge-to-mass ratio - force moving is electrical potential  E
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This note was uploaded on 02/25/2010 for the course BIOL 2800 taught by Professor Salomon during the Spring '09 term at Brown.

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