Ecologia Microbiana del suelo Compendio practico

Ecologia Microbiana - INDICE TEMA Pág Prólogo ii Objetivos del curso iii Normas de Laboratorio iv Introducción vi UNIDAD I El hábitat de los

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Unformatted text preview: INDICE TEMA Pág. Prólogo ii Objetivos del curso iii Normas de Laboratorio iv Introducción vi UNIDAD I. El hábitat de los microorganismos del Suelo Textura 1 Humedad relativa y capacidad de retención de agua 5 pH 9 Materia orgánica 12 Capacidad de intercambio iónico 16 UNIDAD II. Grupos funcionales microbianos 19 Paisaje microbiano del suelo 21 Fijación asimbiótica de nitrógeno 25 Mineralización del nitrógeno orgánico 30 Solubilización del fósforo insoluble 33 Oxidación de azufre reducido 36 UNIDAD III. Interacción microorganismo-planta Producción de auxinas por Azospirillum asociado a una planta Gramínea 39 Simbiosis Rhizobium y Bradyrhizobium con plantas Leguminosas 42 Simbiosis Frankia-Plantas Actinorrízicas 46 Simbiosis de las plantas con hongos Ectomicorrízicos 49 Simbiosis de las plantas con hongos Micorrízico-Arbusculares 53 APÉNDICE 59 PRÓLOGO El presente Compendio está dirigido a los estudiantes del curso de Ecología Microbiana del Suelo de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional. Sin embargo, el deseo de las autoras es que esta obra pueda ser también de utilidad para aquellos interesados en el estudio de las poblaciones microbianas del suelo y su interacción benéfica con las plantas. Esta edición se elaboró con la idea de incorporar prácticas clásicas, que ilustran la relación microorganismo-suelo y microorganismo-planta, así como otras prácticas con temas actualizados. Además de los anteriores, los propósitos con los que este Manual de Laboratorio ha sido elaborado son: - Familiarizar al estudiante con técnicas básicas de estudio de microorganismos del suelo que juegan papeles importantes en la nutrición de las plantas. - Familiarizar al alumno con técnicas que utilizan microorganismos que representan el uso en dosis bajas, no contaminantes, de fertilizantes nitrogenados y fosforados en la producción de las plantas. - Capacitar al estudiante, a través de la experimentación con las mismas técnicas, para comprender el fenómeno microbiológico dentro del ecosistema suelo-vegetación. Algunas de las diferentes técnicas y métodos aquí expuestos han sido adaptados de varios autores y son aplicables en diferentes condiciones de laboratorio. Todas ellas se han seleccionado también por su bajo costo. El Compendio está dividido en cuatro grandes partes: En la primera se presentan las técnicas para el estudio de algunas características físicas y químicas del suelo. Esta parte es de fundamental interés para el estudiante que por primera vez incurre en las ciencias del suelo, pues le permitirá ubicar el fenómeno microbiológico y hacer una mejor interpretación del mismo. La segunda parte se refiere a las poblaciones microbianas del suelo en su conjunto y a la valoración de su actividad biológica en los ciclos del N, P y S. ii En la tercera parte se presenta el capítulo de las diferentes relaciones simbióticas microorganismo-planta, incluyendo la asociación con microorganismos productores de auxinas. Finalmente, se presenta un apéndice con las fórmulas de los medios de cultivo que se emplean y las tablas para el conteo de microorganismos del suelo, utilizando diluciones del mismo. OBJETIVOS GENERALES DEL CURSO El estudiante, como resultado de este curso: - Aprenderá a integrar los conocimientos adquiridos en otros cursos, como fisicoquímica, química, bioquímica, microbiología, fisiología vegetal, ecología microbiana, genética microbiana, etc., en el estudio del suelo. - Podrá demostrar la actividad de los principales grupos microbianos responsables de una función definida en el suelo, relacionada con la nutrición y/o salud de las plantas. - Valorará la acción de los microorganismos del suelo como una alternativa al uso indiscriminado y contaminante de fertilizantes químicos. iii NORMAS DE LABORATORIO En primer término, es necesario recordar que una regla básica para todo laboratorio de Microbiología es el estado sanitario del mismo. El estudiante debe cooperar para mantener limpio el laboratorio. Practique la siguiente disciplina microbiológica: El uso de la bata dentro del laboratorio es obligatorio, ésta le protegerá a usted y a su ropa en caso de accidente o al manejar colorantes, ácidos y álcalis. Por favor manténgala abotonada. En relación con la organización del trabajo de laboratorio, lea cuidadosamente las instrucciones de cada práctica antes de cada sesión. Ponga mucha atención en las indicaciones que ofrezca el instructor, ya que éste pondrá especial énfasis en lo más relevante de la práctica. El área de trabajo debe conservarse limpia y libre de ropa, así como de libros que no se utilicen. Desinfecte su mesa antes y después de llevar a cabo su ensayo. La ropa y objetos personales deben guardarse en las gavetas o áreas especificadas por el instructor. Lave sus manos antes y después de cada sesión de laboratorio. Queda estrictamente prohibido comer, beber y fumar dentro del laboratorio. Dado que en este laboratorio, durante la primera etapa se trabaja con muestras de suelo, es necesario un manejo adecuado del mismo. No lo derrame en las mesas de trabajo ni en el piso del laboratorio, no mezcle diferentes muestras de suelo, jamás retorne el suelo sobrante al frasco de donde fue tomado; el destino del suelo que ya no será utilizado se le indicará al inicio de la práctica. En este laboratorio está prohibido "pipetear" con la boca. Para ello utilice una perilla o una propipeta, el uso de ésta última es lo más adecuado y preciso. Cuando maneje colorantes para tinciones, antes de verterlos en la tarja, deje fluir agua para evitar que éstos se impregnen en la misma. iv Una vez concluido el trabajo con los microscopios, limpie la platina con un paño y el sistema óptico con papel seda. Si utilizó aceite de inmersión no olvide removerlo con papel seda. Una vez limpio el microscopio colóquelo en la gaveta correspondiente. Durante la sesión, deberá mantener apagado su teléfono celular y/o radiolocalizador, para no interrumpir el trabajo de sus compañeros. Riesgos y precauciones Evite contacto directo con los colorantes vitales. Recuerde que todos los colorantes vitales pueden ser cancerígenos, por lo que es conveniente usar guantes para su manejo. Cuando trabaje con el rosa de bengala fenólico, manéjelo dentro de la campana de extracción de humos. Recuerde que el fenol es una sustancia altamente tóxica, corrosiva y cancerígena. Cuando maneje el KCN, evite estar en contacto directo con la solución. Este reactivo es extremadamente venenoso. En algunas prácticas se trabaja con reactivos químicos que son corrosivos como el H2SO4 concentrado, NaOH y HCl al 10%, etc., por lo que es necesario que trabaje con toda la precaución posible. En caso de accidente lávese abundantemente con agua corriente, si se trata de H2SO4 concentrado, aplicar directamente bicarbonato. v INTRODUCCIÓN La Ecología Microbiana del Suelo es una disciplina que tiene como propósito el estudio de las interacciones que existen entre las comunidades microbianas y el ecosistema suelo-vegetación del que ellas forman parte, a saber: a) Interacciones entre las comunidades microbianas y el suelo. b) Interacciones entre las comunidades microbianas y la vegetación. c) Interacciones al interior de las comunidades microbianas. Un ecosistema es la unidad limitada en el espacio, constituida por el conjunto de seres vivos que ahí se encuentran y el conjunto de condiciones fisicoquímicas que se presentan alrededor de los seres vivos. A estas condiciones se les conoce como medio ambiente. La Ecología Microbiana del Suelo es una disciplina que describe el número, actividad e interacciones de los microorganismos presentes en el suelo, así como la forma en que son influenciados por el medio ambiente. Las comunidades microbianas del suelo llevan a cabo el reciclaje de los compuestos que integran la materia orgánica, entre ellos los carbonados , nitrogenados y fosforados. Algunos otros microorganismos pueden ocasionar enfermedades a las plantas; y otros más podrán transformar compuestos contaminantes presentes en el suelo. Además, en este hábitat podemos encontrar una gran cantidad de microorganismos desconocidos, debido a que no ha sido posible cultivarlos. Una de las razones por las que es importante el estudio de los fenómenos microbiológicos del suelo es la de conocer los mecanismos de productividad del mismo, más aún en nuestro país, donde es urgente un cambio en las prácticas agrícolas y silvícolas, por prácticas que conduzcan de una manera racional y económica a la sustentabilidad de la producción de alimentos y madera, y a la conservación o rehabilitación del medio ambiente. En el marco de las interacciones de los microorganismos y los componentes del ecosistema suelovegetación, en este manual se contempla la adquisición de nociones básicas sobre el tema suelo, como base para los estudios de las actividades biológicas de las poblaciones microbianas y las interacciones entre éstas y el medio suelo-vegetación, así como la forma en la que participan en los diferentes ciclos biogeoquímicos. vi INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICASS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA ECOLOGÍA MICROBIANA DEL SUELO COMPENDIO PRÁCTICO INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA ECOLOGÍA MICROBIANA DEL SUELO COMPENDIO PRÁCTICO MARIA VALDÉS NORA MEDINA JARITZ Estilo y sintaxis: GABRIELA SUSANA HERNÁNDEZ SÁNCHEZ 2005 INDICE TEMA Pág. Prólogo ii Objetivos del curso iii Normas de Laboratorio iv Introducción vi UNIDAD I. El hábitat de los microorganismos del Suelo Textura 1 Humedad relativa y capacidad de retención de agua 5 pH 9 Materia orgánica 12 Capacidad de intercambio iónico 16 UNIDAD II. Grupos funcionales microbianos 19 Paisaje microbiano del suelo 21 Fijación asimbiótica de nitrógeno 25 Mineralización del nitrógeno orgánico 30 Solubilización del fósforo insoluble 33 Oxidación de azufre reducido 36 UNIDAD III. Interacción microorganismo-planta Producción de auxinas por Azospirillum asociado a una planta Gramínea 39 Simbiosis Rhizobium y Bradyrhizobium con plantas Leguminosas 42 Simbiosis Frankia-Plantas Actinorrízicas 46 Simbiosis de las plantas con hongos Ectomicorrízicos 49 Simbiosis de las plantas con hongos Micorrízico-Arbusculares 53 APÉNDICE 59 PRÓLOGO El presente Compendio está dirigido a los estudiantes del curso de Ecología Microbiana del Suelo de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional. Sin embargo, el deseo de las autoras es que esta obra pueda ser también de utilidad para aquellos interesados en el estudio de las poblaciones microbianas del suelo y su interacción benéfica con las plantas. Esta edición se elaboró con la idea de incorporar prácticas clásicas, que ilustran la relación microorganismo-suelo y microorganismo-planta, así como otras prácticas con temas actualizados. Además de los anteriores, los propósitos con los que este Manual de Laboratorio ha sido elaborado son: - Familiarizar al estudiante con técnicas básicas de estudio de microorganismos del suelo que juegan papeles importantes en la nutrición de las plantas. - Familiarizar al alumno con técnicas que utilizan microorganismos que representan el uso en dosis bajas, no contaminantes, de fertilizantes nitrogenados y fosforados en la producción de las plantas. - Capacitar al estudiante, a través de la experimentación con las mismas técnicas, para comprender el fenómeno microbiológico dentro del ecosistema suelo-vegetación. Algunas de las diferentes técnicas y métodos aquí expuestos han sido adaptados de varios autores y son aplicables en diferentes condiciones de laboratorio. Todas ellas se han seleccionado también por su bajo costo. El Compendio está dividido en cuatro grandes partes: En la primera se presentan las técnicas para el estudio de algunas características físicas y químicas del suelo. Esta parte es de fundamental interés para el estudiante que por primera vez incurre en las ciencias del suelo, pues le permitirá ubicar el fenómeno microbiológico y hacer una mejor interpretación del mismo. La segunda parte se refiere a las poblaciones microbianas del suelo en su conjunto y a la valoración de su actividad biológica en los ciclos del N, P y S. ii En la tercera parte se presenta el capítulo de las diferentes relaciones simbióticas microorganismo-planta, incluyendo la asociación con microorganismos productores de auxinas. Finalmente, se presenta un apéndice con las fórmulas de los medios de cultivo que se emplean y las tablas para el conteo de microorganismos del suelo, utilizando diluciones del mismo. OBJETIVOS GENERALES DEL CURSO El estudiante, como resultado de este curso: - Aprenderá a integrar los conocimientos adquiridos en otros cursos, como fisicoquímica, química, bioquímica, microbiología, fisiología vegetal, ecología microbiana, genética microbiana, etc., en el estudio del suelo. - Podrá demostrar la actividad de los principales grupos microbianos responsables de una función definida en el suelo, relacionada con la nutrición y/o salud de las plantas. - Valorará la acción de los microorganismos del suelo como una alternativa al uso indiscriminado y contaminante de fertilizantes químicos. iii NORMAS DE LABORATORIO En primer término, es necesario recordar que una regla básica para todo laboratorio de Microbiología es el estado sanitario del mismo. El estudiante debe cooperar para mantener limpio el laboratorio. Practique la siguiente disciplina microbiológica: El uso de la bata dentro del laboratorio es obligatorio, ésta le protegerá a usted y a su ropa en caso de accidente o al manejar colorantes, ácidos y álcalis. Por favor manténgala abotonada. En relación con la organización del trabajo de laboratorio, lea cuidadosamente las instrucciones de cada práctica antes de cada sesión. Ponga mucha atención en las indicaciones que ofrezca el instructor, ya que éste pondrá especial énfasis en lo más relevante de la práctica. El área de trabajo debe conservarse limpia y libre de ropa, así como de libros que no se utilicen. Desinfecte su mesa antes y después de llevar a cabo su ensayo. La ropa y objetos personales deben guardarse en las gavetas o áreas especificadas por el instructor. Lave sus manos antes y después de cada sesión de laboratorio. Queda estrictamente prohibido comer, beber y fumar dentro del laboratorio. Dado que en este laboratorio, durante la primera etapa se trabaja con muestras de suelo, es necesario un manejo adecuado del mismo. No lo derrame en las mesas de trabajo ni en el piso del laboratorio, no mezcle diferentes muestras de suelo, jamás retorne el suelo sobrante al frasco de donde fue tomado; el destino del suelo que ya no será utilizado se le indicará al inicio de la práctica. En este laboratorio está prohibido "pipetear" con la boca. Para ello utilice una perilla o una propipeta, el uso de ésta última es lo más adecuado y preciso. Cuando maneje colorantes para tinciones, antes de verterlos en la tarja, deje fluir agua para evitar que éstos se impregnen en la misma. iv Una vez concluido el trabajo con los microscopios, limpie la platina con un paño y el sistema óptico con papel seda. Si utilizó aceite de inmersión no olvide removerlo con papel seda. Una vez limpio el microscopio colóquelo en la gaveta correspondiente. Durante la sesión, deberá mantener apagado su teléfono celular y/o radiolocalizador, para no interrumpir el trabajo de sus compañeros. Riesgos y precauciones Evite contacto directo con los colorantes vitales. Recuerde que todos los colorantes vitales pueden ser cancerígenos, por lo que es conveniente usar guantes para su manejo. Cuando trabaje con el rosa de bengala fenólico, manéjelo dentro de la campana de extracción de humos. Recuerde que el fenol es una sustancia altamente tóxica, corrosiva y cancerígena. Cuando maneje el KCN, evite estar en contacto directo con la solución. Este reactivo es extremadamente venenoso. En algunas prácticas se trabaja con reactivos químicos que son corrosivos como el H2SO4 concentrado, NaOH y HCl al 10%, etc., por lo que es necesario que trabaje con toda la precaución posible. En caso de accidente lávese abundantemente con agua corriente, si se trata de H2SO4 concentrado, aplicar directamente bicarbonato. v INTRODUCCIÓN La Ecología Microbiana del Suelo es una disciplina que tiene como propósito el estudio de las interacciones que existen entre las comunidades microbianas y el ecosistema suelo-vegetación del que ellas forman parte, a saber: a) Interacciones entre las comunidades microbianas y el suelo. b) Interacciones entre las comunidades microbianas y la vegetación. c) Interacciones al interior de las comunidades microbianas. Un ecosistema es la unidad limitada en el espacio, constituida por el conjunto de seres vivos que ahí se encuentran y el conjunto de condiciones fisicoquímicas que se presentan alrededor de los seres vivos. A estas condiciones se les conoce como medio ambiente. La Ecología Microbiana del Suelo es una disciplina que describe el número, actividad e interacciones de los microorganismos presentes en el suelo, así como la forma en que son influenciados por el medio ambiente. Las comunidades microbianas del suelo llevan a cabo el reciclaje de los compuestos que integran la materia orgánica, entre ellos los carbonados , nitrogenados y fosforados. Algunos otros microorganismos pueden ocasionar enfermedades a las plantas; y otros más podrán transformar compuestos contaminantes presentes en el suelo. Además, en este hábitat podemos encontrar una gran cantidad de microorganismos desconocidos, debido a que no ha sido posible cultivarlos. Una de las razones por las que es importante el estudio de los fenómenos microbiológicos del suelo es la de conocer los mecanismos de productividad del mismo, más aún en nuestro país, donde es urgente un cambio en las prácticas agrícolas y silvícolas, por prácticas que conduzcan de una manera racional y económica a la sustentabilidad de la producción de alimentos y madera, y a la conservación o rehabilitación del medio ambiente. En el marco de las interacciones de los microorganismos y los componentes del ecosistema suelovegetación, en este manual se contempla la adquisición de nociones básicas sobre el tema suelo, como base para los estudios de las actividades biológicas de las poblaciones microbianas y las interacciones entre éstas y el medio suelo-vegetación, así como la forma en la que participan en los diferentes ciclos biogeoquímicos. vi UNIDAD I. EL HÁBITAT DE LOS MICROORGANISMOS DEL SUELO PRÁCTICA 1.- TEXTURA INTRODUCCIÓN El término suelo se refiere al material exterior, poco compacto, de la superficie terrestre; uno de sus componentes principales es la fracción mineral, ésta proviene del material parental y es el producto de la desintegración de las rocas provocado por el intemperismo físico, químico y bioquímico. La fracción mineral del suelo está constituida por partículas de diferentes tamaños: arena (200-20 micras), limo (20-2 micras) y arcillas (menos de 2 micras). La cantidad de cada uno de los componentes de esta fracción varía de un suelo a otro y depende directamente del material de origen. A la proporción relativa de arena, limo y arcilla, expresada en porcentaje, se le conoce como textura del suelo. La textura afecta el número y tamaño de los poros y, por lo tanto, el espacio poroso de cada suelo. La humedad, aireación y consecuentemente la actividad de los microorganismos en el suelo, están en función de la textura. OBJETIVO El estudiante estimará la proporción en que se encuentran las partículas minerales (arena, limo y arcilla) en diferentes suelos. MATERIAL Hidrómetro de Bouyoucos Probeta ajustada a 1130 ml Equipo para dispersar (batidora o licuadora con vaso dispersador) Termómetro graduado de 0 a 50º C Balanza Cronómetro Agua destilada Sol. acuosa de hexametafosfato de sodio al 5% Peróxido de hidrógeno al 30 % Vaso de precipitados de 500 ml Piseta Suelo secado en estufa a 110º C y tamizado en malla de 2 mm Papel de estraza Charolas para pesar suelo Pipetas serológicas de 10 ml Probeta de 25 ml Cucharas de plástico 1 PROCEDIMIENTO Eliminación de la materia orgánica. Pese 50 g de suelo si la muestra es de textura fina; si es de textura arenosa pese 100 g. Para eliminar la materia orgánica presente, trate la muestra con H2O2 al 30 % en una proporción de 15 ml de reactivo por cada 50 g de suelo. Deje secar 24 horas a 80ºC. Dispersión. Coloque la muestra tratada en un vaso de precipitados de 500 ml, agréguele 10 ml de la solución de hexametafosfato de sodio y 250 ml de agua destilada. Deje en reposo durante 15 minutos. Vierta la muestra preparada en el vaso de la batidora o licuadora y agregue suficiente agua destilada hasta llegar a 10 cm por abajo del borde superior del vaso. Disperse durante 5 a 10 minutos. Si el suelo es arenoso, no es necesario dispersar mecánicamente. Lecturas en el hidrómetro. Vacíe el dispersado íntegramente en la probeta ajustada a 1130 ml, utilice una piseta para bajar todo el contenido, afore con el hidrómetro inmerso, hasta 1130 ml con agua destilada, si usó 50 g de suelo, y a 1250 ml si empleó 100 g. Quite el hidrómetro y tape la probeta con una mano para mezclar la muestra, a fin de incorporar a la suspensión el sedimento formado. Cuando logre ésto, coloque en posición vertical la probeta y accione el cronómetro para hacer la primer lectura con el hidrómetro a los 40 segundos, midiendo al mismo tiempo la temperatura para hacer las correcciones, como se indica más adelante. Deje la probeta en reposo durante 2 horas y vuelva a introducir el hidrómetro, sin agitar y teniendo cuidado de que el mismo no toque o quede pegado a las paredes de la probeta. Nota: El éxito del método de Bouyoucos para determinar textura depende de la completa dispersión de las partículas minerales del suelo, ésta se obtiene cuando las aspas de agitación están en buenas condiciones y el tiempo de dispersión es suficiente. Cálculos: Por cada grado arriba de 19.4º C agregue a la lectura del hidrómetro 0.36 unidades, y por cada grado abajo de 19.4º C reste a la lectura del hidrómetro 0.36 unidades. Primera lectura corregida X100 =% de (limo + arcilla) Peso de la muestra 100 - % de (limo + arcilla) = % de arena Segunda lectura corregida X100 - % de (arena + arcilla) = % de limo Peso de la muestra 2 Nota: Obtenga la clasificación del suelo de acuerdo a su textura en el Triángulo de Texturas (Fig. 1) anexo. REPORTE 1.- Explique la relación que existe entre la textura de los suelos y su contenido de humedad. 2.- Explique la importancia que tiene el conocimiento de la textura de los suelos, así como sus posibles aplicaciones prácticas. 3.-Discusión y conclusiones. BIBLIOGRAFÍA. Brady, C.N. 1974. The nature and properties of soil. Mac Millan Publishing Co. Inc. 8th Edition. New York. Ortíz Villanueva, B. y C.A. Ortíz Selorio. 1984. Edafología. Editorial de la Universidad Autónoma de Chapingo, Texcoco, México. Jackson, M.L. 1970. Análisis químico de suelos. 2ª edición. Editorial Omega. Barcelona. Millar, C. E., Turk, L. M y Foth, H. D. 1972. Fundamentos de la Ciencia del Suelo. Cía. Editorial Continental (C.E.C.S.A.). México. 3 Fig. 1.- Triángulo para determinar la clasificación textural de los suelos (Brady, 1980). 4 PRÁCTICA 2. HUMEDAD RELATIVA Y CAPACIDAD DE RETENCIÓN DE AGUA. INTRODUCCIÓN El agua es necesaria para la vida, es el mayor componente celular y gobierna la actividad de los microorganismos del suelo; cuando la humedad es excesiva, el intercambio gaseoso es limitado, provocando condiciones de anaerobiosis. El desarrollo máximo de los microorganismos aerobios del suelo, responsables de algunos de los procesos más importantes de éste, tiene lugar cuando el contenido de humedad relativa es mayor de las dos terceras partes de la capacidad de campo, que es como se le denomina a la capacidad de retención de agua del suelo. El agua en el suelo se encuentra fuertemente retenida en las partículas arcillosas y en el humus (agua higroscópica), medianamente detenida en los poros o espacios pequeños que hay entre las partículas (agua capilar) y se escurre de los macroporos o grandes espacios que hay entre las partículas (agua de gravedad) (Fig. 2). Ya que el agua de gravedad escurre, y el agua higroscópica está fuertemente retenida porque forma parte de los coloides (arcilla y humus), solo una parte del agua en el suelo está disponible para las plantas. El nivel de humedad óptimo para la actividad biológica en el suelo es en general de 50 a 70 % de la capacidad de retención. OBJETIVO El estudiante evaluará en diferentes tipos de suelo, la cantidad de agua disponible para las plantas. A.- HUMEDAD RELATIVA MATERIAL Estufa moderna Balanza analítica Desecador Caja de Petri de vidrio Suelo recién colectado y tamizado por malla de 2 mm Papel de estraza Cucharas de plástico PROCEDIMIENTO - Pese 10 g de suelo en una caja de Petri mantenida a peso constante. - Coloque la caja de Petri conteniendo el suelo en la estufa a 80ºC durante 24 horas. Pese y coloque nuevamente en la estufa hasta obtener peso constante. 5 Cálculos: - Calcule el contenido de humedad como porcentaje del peso del suelo secado en la estufa. Humedad (H) = (peso del suelo húmedo) - (peso del suelo seco). H x 100 % de humedad= 10 B.- CAPACIDAD DE RETENCIÓN DE AGUA O CAPACIDAD DE CAMPO MATERIAL Estufa Balanza analítica Disco de papel filtro Embudo Bases de Caja Petri Papel de estraza Suelo tamizado y secado en la estufa a 80ºC Charolas para pesar suelo PROCEDIMIENTO - Pese de 5 a 10 g de suelo seco. - Coloque un disco de papel filtro en un embudo. - Humedezca el papel filtro. - Coloque el suelo sobre el papel filtro húmedo y péselo. - Adicione agua al suelo hasta que se sature. Deje que escurra el agua. - Cuando haya escurrido toda el agua, pese el suelo + el papel filtro. - Calcule la cantidad de agua retenida por unidad de peso de suelo seco y utilice este valor para calcular la capacidad de retención de agua del suelo problema. Cálculos: Unidad = Papel filtro saturado con agua + suelo Peso de la unidad con el suelo saturado = Peso del papel filtro húmedo + Peso de la muestra del suelo (10 g). 6 Peso del papel filtro Agua retenida = con el suelo saturado con agua Peso de la unidad con el suelo saturado - Peso del papel filtro con el suelo no saturado (seco) Peso peso de la muestra del = Peso del papel filtro húmedo + suelo (10 g). Capacidad de retención de agua = [ Agua retenida X 100 ]/10 REPORTE 1.- ¿Cuál fue la humedad relativa del suelo en estudio? 2.- Reporte la capacidad de retención de agua del suelo. 3.- ¿Por qué es importante conocer estas variables en el suelo? 4.- ¿De qué componentes del suelo dependen estas propiedades? 5.- Discusión y conclusiones. BIBLIOGRAFÍA Brady, C.N. 1974. The nature and properties of soil. Mac Millan Publishing Co. Inc. 8th Edition. New York. Ortíz Villanueva, B. y C.A. Ortíz Selorio. 1984. Edafología. Editorial de la Universidad Autónoma de Chapingo, Texcoco, México. Jackson, M.L. 1970. Análisis químico de suelos. Segunda edición. Editorial Omega. Barcelona. Millar, C. E., Turk, L. M y Foth, H. D. 1972. Fundamentos de la Ciencia del Suelo. Cía. Editorial Continental (C.E.C.S.A.). México 7 Fig. 2.- Los tres tipos de agua del suelo 8 PRÁCTICA 3. pH INTRODUCCIÓN Esta propiedad química es quizá la más importante de un suelo como medio destinado al cultivo de plantas y, por lo tanto, igualmente importante para los microorganismos presentes en él. Sin embargo, el pobre crecimiento de los cultivos en suelos ácidos no se debe directamente a la elevada concentración de H+, a menos que el pH sea inferior a 4.0. Los efectos negativos de la acidez del suelo son indirectos y entre ellos están: 1.- Alta concentración de aluminio intercambiable o en solución. 2.- Retención de fósforo. 3.- Exceso de manganeso en solución. 4.- Deficiencias de calcio, magnesio y/o molibdeno. 5.- Reducida actividad microbiológica. 6.- Reducida capacidad de intercambio catiónico La determinación del pH del suelo, efectuada en las condiciones de humedad natural, debe ser considerada como la más válida en función del ambiente biológico existente en el mismo. En general, cuanto más diluida sea la suspensión del suelo, mayor será el valor del pH encontrado. OBJETIVO El estudiante determinará y comparará el pH de diversos suelos y explicará las diferencias encontradas. MATERIAL Potenciómetro Balanza granataria Soluciones reguladoras de pH 4.0 y 7.0 Vaso de precipitados de 150 ml Agitador de vidrio Suelo recién colectado o bien almacenado Piseta con agua destilada Cucharas de plástico Charolas para pesar suelo Papel de estraza PROCEDIMIENTO En el campo: Tome 15 muestras representativas y mézclelas para formar una sola. Haga inmediatamente la determinación o en caso contrario pase la muestra a un frasco de vidrio con tapón de baquelita, 9 ciérrelo herméticamente con el propósito de impedir el contacto con trazas de amoniaco u otros compuestos presentes en el laboratorio que puedan modificar el pH. En el laboratorio: Pese 10 g de la muestra por analizar y vacíelos dentro de un vaso de precipitados de 150 ml, en donde se agregan 20 ml de agua destilada; mezcle perfectamente con ayuda de un agitador. Deje reposar la muestra durante 30 minutos; después de este tiempo agítelo y haga la lectura en el potenciómetro previamente calibrado después de 15 minutos de haberse encendido. Cuadro 1. Clasificación tentativa del pH del suelo y de aguas agrícolas, según el Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA): ____________________________________________________________________________ pH Clasificación Menor de 4.60 Extremadamente ácido 4.60 a 5.19 Muy fuertemente ácido 5.20 a 5.59 Fuertemente ácido 5.60 a 6.19 Medianamente ácido 6.20 a 6.59 Ligeramente ácido 6.60 a 6.79 Muy ligeramente ácido 6.80 a 7.19 Neutro 7.20 a 7.39 Muy ligeramente alcalino 7.40 a 7.79 Ligeramente alcalino 7.80 a 8.39 Medianamente alcalino 8.40 a 8.79 Fuertemente alcalino 8.80 a 9.39 Muy fuertemente alcalino Mayor de 9.40 Extremadamente alcalino ____________________________________________________________________________ REPORTE 1.- Explique cuál es el origen de los iones hidrógeno del suelo. 2.- ¿Cuál es la influencia del pH en la disponibilidad o el intercambio de los nutrientes del suelo? 10 3.- Explique la relación que existe entre la capacidad de intercambio iónico y el pH del suelo. 4.- Discusión y conclusiones BIBLIOGRAFÍA Aguilar Santelises, A., J. D. Etchevers Barra y J. Z. Castellanos Ramos. 1987. Análisis químico para evaluar la fertilidad del suelo. Sociedad Mexicana de la Ciencia del Suelo. México. Brady, C.N. 1974. The nature and properties of soil. Mac Millan Publishing Co. Inc. 8th Edition. New York. Ortíz Villanueva, B. y C.A. Ortíz Solorio. 1984. Edafología. Editorial de la Universidad Autónoma de Chapingo, Texcoco, México. Moreno-Dahme, R. 1970. Cuadro de clasificaciones tentativas de suelos. Departamento de Suelos, INIA/SAR. México. Jackson, M.L. 1970. Análisis químico de suelos. Segunda edición. Editorial Omega. Barcelona. Millar, C. E., Turk, L. M y Foth, H. D. 1972. Fundamentos de la Ciencia del Suelo. Cía. Editorial Continental (C.E.C.S.A.). México. 11 PRÁCTICA 4. MATERIA ORGÁNICA INTRODUCCIÓN El contenido de materia orgánica es objeto de determinaciones rutinarias en todos los laboratorios de análisis de suelos. Este factor es fundamental por su influencia directa e indirecta sobre las propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo, tales como: color, estructura, plasticidad, capacidad de retención de agua, capacidad de intercambio iónico, disponibilidad de nitrógeno, fósforo y azufre, pH, susceptibilidad a la erosión, etc. La fracción orgánica del suelo consta de residuos de plantas y animales en diferentes estados de descomposición e incluye a todos los microorganismos del suelo. No es uniforme en su constitución y continuamente ocurren cambios en ella. El carbono orgánico en el suelo está contenido en la materia orgánica y en formas mineralizadas como grafito y carbón vegetal. Si hacemos uso de una técnica que determine el contenido de materia orgánica a través de la evaluación de carbono orgánico, es necesario que la técnica elegida permita discriminar entre las dos fuentes. El método de Walkey y Black está basado en la oxidación lenta de la materia orgánica (carbono orgánico) con ácido crómico que se calienta por dilución con H2SO4. Con este método se oxida un poco menos que el total de la materia orgánica, lo que es considerado por algunos autores como una ventaja, ya que se excluye la fracción de materia orgánica menos activa. Además, debido al calentamiento poco intenso, permite diferenciar en gran parte la materia que integra el humus del suelo de las fuentes extrañas de carbón orgánico (grafito y carbón vegetal), lo que constituye una ventaja evidente. Por esta razón y por su simplicidad, es el método más empleado para estimar la materia orgánica de los suelos. OBJETIVO El estudiante determinará y comparará el contenido de materia orgánica oxidable de diferentes suelos mediante el método de Walkey y Black. MATERIAL Matraz Erlenmeyer de 500 ml Pipetas serológicas de 10 y 20 ml Bureta de 25 ml Balanza analítica K2Cr2O7 1N Agua destilada H3PO4 al 85 % H2SO4 concentrado QP Probeta de 250 ml Soporte universal Difenilamina FeSO4.7H2O 1N Suelo secado al aire y tamizado por malla de 0.5 mm Frascos goteros de 10 ml (plástico) Charolas para pesar suelo, Papel de estraza Cucharas de plástico Vaso de precipitados de 100 ml Vaso de precipitados de 500 ml Pinzas para bureta Nota: Para preparar las soluciones consulte el apéndice. 12 PROCEDIMIENTO Oxidación de la materia orgánica. Coloque 1 g de suelo en un matraz Erlenmeyer de 500 ml. Si observa que el suelo es muy rico en materia orgánica, ponga de 250 a 500 mg. A continuación añada con una pipeta, 10 ml de K2Cr2O7 1N sobre el suelo, mezclando con movimientos circulares del matraz. Añada enseguida, lentamente, 20 ml de H2SO4 concentrado, siga mezclando durante un minuto para asegurar la interacción de los reactivos con el suelo. Evite que el suelo quede adherido a las paredes del matraz fuera del contacto de los reactivos. Deje reposar la mezcla se durante 30 minutos. Simultáneamente realice un ensayo de valoración en blanco (de la misma forma, pero sin suelo). Valoración por retroceso. Diluya la mezcla a 200 ml con agua destilada y añada 10 ml de H3PO4 al 85 % y 30 gotas de indicador de difenilamina; valore por retroceso con la solución de FeSO4 1N colocada en una bureta. Nota 1 Al principio, el color es verde oscuro debido a los iones cromo y se desplaza hacia un azul turbio a medida que avanza la titulación, en el punto final, este color cambia bruscamente a verde brillante. Nota 2 Si gasta menos de 2 ml de FeSO4, repita el ensayo utilizando menor cantidad de suelo. REACCIONES 2K2Cr2O7 + 8H2SO4 + 3C 2Cr2(SO4)3 + 2K2SO4 + 3CO2 + 8H2O K2Cr2O7 + 7H2SO4 + 6FeSO4 K2SO4 + Cr2(SO4)3 + 3Fe2(SO4)3 + 7H2O Cálculos: Realice los cálculos mediante la siguiente ecuación: % de materia orgánica = 10 (1 – donde: P T ) X 0.67 P = ml de solución de FeSO4 1N gastados por el problema. T = ml de solución de FeSO4 1N gastados por el blanco. El factor 0.67 se deduce de la siguiente forma: 13 1N X 12 4000 X 1.0 0.77 X 100 X 1.72 = 0.67 1.0 1N = Normalidad del K2Cr2O7 12/4000 = Peso miliequivalente del carbón. 1.0 g = Peso de la muestra de suelo. 1.0/0.77 = Cantidad de carbono total de la materia orgánica que se oxida por este método, que es igual a 77 %. 1.72 = Factor de transformación del carbono orgánico a materia orgánica del suelo que contiene 58 % de carbono orgánico. Cuando se trabaja con otra cantidad de suelo, el 1.0 se substituye por la cantidad específica utilizada. Cuadro 2. Tipos de suelo de acuerdo a su contenido de materia orgánica, según el INIA (Moreno-Dahme, 1970). __________________________________________________________________________ % de materia orgánica Interpretación __________________________________________________________________________ 0.0 a 0.25 Extremadamente pobre 0.26 a 0.50 Muy pobre 0.51 a 1.00 Pobre 1.01 a 2.00 Mediano 2.01 a 3.00 Rico 3.01 a 4.00 Muy rico 4.01 a 5.00 Extremadamente rico ___________________________________________________________________________ REPORTE 1.- Explique el fundamento de la determinación de materia orgánica por el método de Walkey y Black. 2.- ¿Qué influencia tiene la materia orgánica en la capacidad de retención de agua del suelo? 14 3.- Discusión y conclusiones BIBLIOGRAFÍA Aguilar Santelises, A., J. D. Etchevers Barra y J. Z. Castellanos Ramos. 1987. Análisis químico para evaluar la fertilidad del suelo. Sociedad Mexicana de la Ciencia del Suelo. México. Brady, C.N. 1974. The nature and properties of soil. Mac Millan Publishing Co. Inc. 8th Edition. New York. Ortíz Villanueva, B. y C.A. Ortíz Solorio. 1984. Edafología. Editorial de la Universidad Autónoma de Chapingo, Texcoco, México. Jackson, M.L. 1970. Análisis químico de suelos. Segunda edición. Editorial Omega. Barcelona. Millar, C. E., Turk, L. M y Foth, H. D. 1972. Fundamentos de la Ciencia del Suelo. Cía. Editorial Continental (C.E.C.S.A.). México. Moreno-Dahme, R. 1970. Cuadro de clasificaciones tentativas de suelos. Departamento de Suelos, INIA/SAR. México. 15 PRÁCTICA 5. CAPACIDAD DE INTERCAMBIO IÓNICO INTRODUCCIÓN Las fracciones finas mineral y orgánica del suelo (arcilla y humus), por ser partículas coloidales exponen una gran superficie por unidad de volumen, además presentan carga negativa en su superficie. Esto les permite el intercambio de cationes que están en solución en el suelo, por otros cationes que se encuentran neutralizando a las cargas negativas de la arcilla y el humus. Una parte de los cationes liberados de la arcilla son absorbidos por las raíces de las plantas y por los microorganismos del suelo para su nutrición. La capacidad de intercambio iónico es una medida de esta capacidad de los coloides, los cuales actúan como reservorios para los nutrientes minerales. La capacidad de intercambio iónico varía de acuerdo a la cantidad y tipo de arcilla, y a la materia orgánica presente en el suelo. Esta característica es importante para clasificar a los suelos desde el punto de vista de la fertilidad. La capacidad de intercambio iónico fluctúa de 1.0 a más de 50 meq/100 g de suelo. OBJETIVO El estudiante determinará y comparará la capacidad de intercambio iónico de diferentes suelos. MATERIAL Balanza granataria Solución de CaCl2 1 N pH 7.0 Bureta de 25 ml CH3-CH2OH de 96º Pipetas sexológicas de 10 ml Solución de NaCl 1 N pH 7.0 Pipetas sexológicas de 1 ml Solución de EDTA 0.1 N Papel filtro Whatman # 2 Solución amortiguadora de pH 10 Suelo secado al aire y tamizado en malla de 2 mm Solución de NH2OH-HCl Embudos Buchner. Solución de KCN al 2% Vasos de precipitados de 250 ml Solución de Negro de Eriocromo T Soporte universal con pinza para bureta Solución estándar de Ca 0.01 N Matraces Erlenmeyer de 250 ml Goteros de plástico de 10 ml Cucharas de plástico Papel de estraza Anillos de fierro para soporte universal Charolas para pesar suelo Nota: Para la preparación de las soluciones consulte el apéndice PROCEDIMIENTO Pese 5 g de suelo y colóquelo en un embudo de Buchner que contenga un papel filtro. 16 Adicione lentamente 10 ml de la solucion de CaCl2 1N, cubriendo toda la superficie de la muestra de suelo. Recolecte la solución filtrada en un vaso de precipitados de 250 ml, este filtrado se desecha. Repita esta operación cuatro veces más. Adicione lentamente 10 ml de CH3-CH2OH de 96º, cubriendo toda la superficie de la muestra de suelo. Recolecte la solución filtrada en un vaso de precipitados de 250 ml y deséchelo. Repita esta operación cuatro veces más. Adicione lentamente 10 ml de la solución de NaCl, cubriendo toda la superficie de la muestra de suelo. Recolecte la solución filtrada en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Repita esta operación cuatro veces más. (Cuidado, este filtrado no se desecha). En el filtrado de NaCl, titule los iones calcio por el método del versenato. Método del Versenato Agregue al filtrado 10 ml de la solución amortiguadora pH 10 Adicione 5 gotas de la solución de KCN. Agregue 5 gotas de la solución de NH2OH-HCl. Adicione 5 gotas del indicador Negro de Eriocromo T. Titule con la solución de verseno hasta que el color de la solución vire de púrpura a color azul. Cálculos: Capacidad de intercambio catiónico total (C.I.C.T.) C.I.C.T. en meq por 100 g de suelo = ml de EDTA X N X 100 g de muestra de suelo Normalización de la solución del dietilendinitrilotetracetato-disódico (EDTA): 1.- Coloque alícuotas de 10 ml de la solución estándar de calcio en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y agregue 100 ml de agua destilada (hacerlo por duplicado o triplicado). 2.- Agregue a cada matraz 10 ml de solución amortiguadora pH 10. 3.- Agregue 5 gotas de solución de KCN. 4.- Agregue 5 gotas del indicador negro de eriocromo T. 17 5.-Titule con la solución de EDTA agitando frecuentemente el matraz hasta obtener el color azul. Normalidad del EDTA (N) = 0.01 N X 10 ml ml de EDTA gastados REPORTE 1.- Escriba las características de los coloides del suelo 2.- ¿Cuál es la importancia de la determinación de la capacidad de intercambio iónico de un suelo? 3.- Discusión y conclusiones BIBLIOGRAFÍA Aguilar Santelises, A., J. D. Etchevers Barra y J. Z. Castellanos Ramos. 1987. Análisis químico para evaluar la fertilidad del suelo. Sociedad Mexicana de la Ciencia del Suelo. México. Brady, C.N. 1974. The nature and properties of soil. Mac Millan Publishing Co. Inc. 8th Edition. New York. Ortíz Villanueva, B. y C.A. Ortíz Solorio. 1984. Edafología. Editorial de la Universidad Autónoma de Chapingo, Texcoco, México. Jackson, M.L. 1970. Análisis químico de suelos. Segunda edición. Editorial Omega. Barcelona. Millar, C. E., Turk, L. M y Foth, H. D. 1972. Fundamentos de la Ciencia del Suelo. Cía. Editorial Continental (C.E.C.S.A.). México. 18 UNIDAD II. GRUPOS FUNCIONALES MICROBIANOS DEL SUELO INTRODUCCIÓN En el suelo existen diferentes grupos de microorganismos que participan en los ciclos biogeoquímicos en diferentes actividades, a través de las cuales se movilizan los elementos esenciales para la vida, constituyendo así grupos funcionales. Generalmente, cada grupo funcional está conformado por diferentes poblaciones que pueden incluir bacterias y hongos. Entre los diversos grupos funcionales del suelo destacan los amonificantes, nitrificantes, desnitrificantes, fijadores de nitrógeno, celulolíticos, amilolíticos, pectinoliticos, mineralizadores, oxidadores y reductores de azufre, fósforo, potasio, fierro, etc. Todos estos microorganismos afectan la movilidad de los nutrientes inorgánicos en el suelo, facilitando o impidiendo el libre tránsito de éstos entre los coloides del mismo. Posteriormente, los nutrientes pueden ser intercambiados con las plantas que dependen directamente de ellos. Todos los grupos microbianos pueden cuantificarse inoculando con suelo tubos con medio selectivo líquido y utilizando las tablas de MacGrady. Su actividad biológica se puede interpretar con el trazado de curvas en función del tiempo y de las diluciones. Los medios de cultivo llevan básicamente una solución salina (la de Winogradsky) más una fuente de carbono y una de nitrógeno específicas (Cuadro 3). En el caso de los grupos funcionales de los diferentes ciclos hay que adicionar la fuente del elemento a estudiar, ya sea en forma orgánica (para estudiar su mineralización), en forma reducida (para ver su xidación) o en forma oxidada (para estudiar su reducción). Sin olvidar que todos los nutrientes de las plantas son previamente metabolizados por los microorganismos del suelo, en esta parte del curso estudiaremos la participación de algunos grupos microbianos importantes en la transformación de nutrientes esenciales para las plantas y abordaremos procesos tales como el uso de una molécula inerte (el nitrógeno molecular), la mineralización, la oxidación y la solubilización microbianas. 19 GRUPO FUNCIONAL FUENTE FUENTE DE INCUBACIÓN BÚSQUEDA A DE NITRÓGENO DE... TRAVÉS CARBONO DE... 1. Fijadores libres Aerobia o Velo en la Ningún de N2 Glucosa --anaerobia superficie del reactivo medio 2. Amonificadores Glucosa Un aminoácido Aerobia o NH4+ Nessler anaerobia + 3. Nitrificadores --NH4 Aerobia o NO2Griess I y anaerobia II 4. Desnitrificadores Glucosa KNO3 Aerobia o NO2 Griess I y anaerobia II Celulosa Aerobia o Colonias de (Papel filtro) 5. Celulolíticos NH4NO3 anaerobia color en el Ninguno papel 6. Amilolíticos Almidón NH4NO3 Aerobia o Pérdida de Yodo anaerobia color azul iodurado FeS 7. Mineralizadore Lactato de Aminoácido Aerobia o (anaerobiosis s de azufre sodio azufrado anaerobia ) SO4 (aerobiosis) 8. Oxidadores de NH4NO3 Aerobia SO4= BaCl2+HCl S (S y H2S) 9. Sulfato Lactato de NH4Cl Anaerobia FeS Feº (un reductores sodio clavo) Cuadro 3.- Grupos funcionales de microorganismos del suelo, cuya clasificación se puede establecer en medios de cultivo mínimos con base en la selección de las fuentes de carbono y de nitrógeno (adaptado de Pochon y Tardieux, 1962). 20 PRÁCTICA 6. UN PAISAJE MICROBIANO DEL SUELO INTRODUCCIÓN Uno de los retos de los microbiólogos que estudian el suelo es poder observar los microorganismos in situ, sin alteraciones indeseadas en su hábitat. La técnica de Rossi-Cholodny, que utiliza portaobjetos enterrados, es una herramienta ecológica simple y útil para observar la relación espacial que guardan los microorganismos del suelo entre sí y con el suelo mismo. Según Winogradsky, es la observación de un paisaje microbiano. Esta técnica, aunque fue diseñada hace muchos años, todavía se emplea para estudiar cualitativamente las poblaciones microbianas del suelo; es especialmente útil para demostrar las relaciones espaciales entre los microorganismos y puede proveer mucha información en relación con los cambios poblacionales producidos por algún factor externo como la temperatura, la humedad, la adición de fuentes de carbono, etc. Si observa con cuidado, podrá encontrar muchos microorganismos desconocidos, se trata de organismos no cultivables. OBJETIVO El estudiante observará la imagen en conjunto de las relaciones que guardan los microorganismos entre sí y con las partículas del suelo (Fig. 3). MATERIAL Muestras de suelo fresco Papel aluminio Portaobjetos Balanza granataria Vasos de precipitados de 100 ml Vasos de precipitados de 250 ml o frascos de boca ancha Probetas de 50 y 100 ml Baño María (tripie, cristalizador, mechero Bunsen) Puentes de coloración Cucharas de plástico Charolas para pesar suelo Microscopio compuesto Aceite de inmersión Papel seda Encendedor o cerillos Agua destilada Papel de estraza Goteros de 50 ml Etanol 96º Solución de ácido acético al 40 % Colorante rosa de bengala fenólico Sacarosa (comercial) Nitrato de amonio 21 PROCEDIMIENTO -Pese dos muestras de 200 g de suelo, a una adiciónele una fuente de carbono más una fuente de nitrógeno (1% de sacarosa y 0.05% de NH4NO3), deje sin tratamiento la otra muestra. Coloque cada muestra en un vaso de precipitados o en un frasco de boca ancha. -Adicione agua hasta alcanzar el 60% de la capacidad de retención de agua (capacidad de campo) del mismo y mezcle bien. -Inserte verticalmente 2 o 3 portaobjetos limpios en el suelo de cada recipiente. Asegúrese de que al menos, 2/3 de cada portaobjetos está dentro del suelo. -Tape los recipientes con papel aluminio e incube a 28ºC. -Después de una semana, seleccione uno de los portaobjetos del suelo y proceda de la siguiente manera: a).- Sáquelo con suavidad del suelo, límpielo cuidadosamente de una de sus caras con papel húmedo, cuide que la otra cara permanezca sin alterar, ésa es la cara que se va a teñir. b).- Para eliminar las partículas grandes del suelo de la cara a teñir, golpee suavemente el portaobjetos contra un papel de estraza en la mesa de trabajo. c).- Adicione CH3COOH al 40 % al portaobjetos y déjelo actuar 3 minutos. Lave el exceso de ácido, sin que el chorro de agua caiga directamente sobre el portaobjetos. d).- En la campana de extracción, tiña la impronta colocando el portaobjetos en un puente de coloración que esté sobre un baño con agua hirviendo; cúbralo con rosa de bengala fenólico y manténgalo a emisión de vapores durante 10 minutos. No permita que se seque. e).- Lave cuidadosamente para eliminar el exceso de colorante. Deje secar y observe al microscopio a 40X y 100X. Tenga mucho cuidado con los objetivos del microscopio, pues las partículas minerales del suelo que se quedan en el portaobjetos pueden dañar las lentes. -Observe el tamaño y forma de las células bacterianas, filamentos y esporas de actinomicetos y de hongos. Observe la relación entre los mismos y las partículas del suelo. Identifique las evidencias de grupos microbianos, formación de colonias, protocooperación, etc. Nota: Para preparar la solución de rosa de bengala fenólico, consulte el apéndice. REPORTE 22 1.- Describa las diferencias que observó, en las poblaciones microbianas de los suelos tratados y sin tratar. 2.- ¿Observó alguna evidencia de que algún grupo de microorganismos interacciona estrechamente con otro grupo? Describa. 3.- Mencione cómo diferenció un filamento de un actinomiceto del de un hongo. 4.- ¿Cómo influyeron los resultados de esta práctica en su concepto del desenvolvimiento de los microorganismos en el suelo? Su respuesta a esta pregunta es muy importante. 5. -Discusión y conclusiones BIBLIOGRAFÍA Rossi, G., Riccardo, S., Geseu, G., Stanganelli, M. y Wang, T.K. 1936. Direct microscopic and bacteriological examination in soil. Soil. Science 41: 53. Stotzky, G. 1997. Soil as an enviroment for microbial life. In: J.D. Van Elsas, J.T., Trevors and E.M.H. Wellington (eds.). Modern Soil Microbiology. pp 1-20. Marcel Dekker, Inc. New York. Pramer, D. y E. L. Schmidt. 1965. Experimental Soil Microbiology. Burgess Publishing Company, Minnesota. 23 24 PRÁCTICA 7. CICLO DEL NITRÓGENO: FIJACIÓN ASIMBIÓTICA DE NITRÓGENO INTRODUCCIÓN La primera fase del ciclo del nitrógeno es la fijación. Este término se refiere al fenómeno de activar el nitrógeno del aire que es inerte (N2) y transformarlo en asimilable (NH3). Los microorganismos fijadores pueden ser bacterias asimbióticas (aerobias, anaerobias y fotosintéticas) y simbióticas (bacterias asociadas a leguminosas, bacterias asociadas a gramíneas y bacterias filamentosas asociadas a ciertos árboles y arbustos llamados plantas actinorrízicas); también tienen esta capacidad algunas cianobacterias simbióticas. Todos estos microorganismos poseen el equipo enzimático que les permite metabolizar el nitrógeno atmosférico (N2). Cualquiera que sea el microorganismo, el metabolismo final conduce fundamentalmente a la síntesis de proteínas. Es decir, a través de este fenómeno, el nitrógeno molecular es introducido al suelo en forma orgánica (Fig. 4). OBJETIVO El estudiante diferenciará las características microscópicas y coloniales de algunos microorganismos del suelo que fijan nitrógeno en el mismo, ya sea en forma aerobia o anaerobia; así como la incidencia de ellos en el suelo que se estudie. MATERIAL Cajas Petri de vidrio con silicagel más medio selectivo para fijadores asimbióticos Vidrios de reloj Varillas de vidrio con punta o palillos Equipo de coloración Gram Mechero Bunsen Puentes de coloración CH3-CH2OH 96º Porta y cubreobjetos PROCEDIMIENTO Cámara de humedad constante Suelo secado al aire y tamizado por malla de 2 mm Cajas Petri desechables Encendedor o cerillos Asa microbiológica Microscopio compuesto Aceite de inmersión Papel seda Técnica de siembra de granos de suelo sobre el medio selectivo para fijadores asimbióticos (Fig. 4). - Deposite lo más regularmente posible, 20 granos de suelo por caja, con la ayuda de una varilla de vidrio con punta o con un palillo, de la siguiente forma: a) Coloque agua en un vidrio de reloj b) Humedezca ligeramente la punta de la varilla de vidrio o el palillo 25 c) Con la varilla o palillo humedecido toque ligeramente el grano de suelo, notará que éste se adhiere d) Coloque suavemente el grano de suelo sobre el medio de cultivo sílica gel - Coloque las cajas sembradas en la estufa, en atmósfera húmeda a 28-30º C. Las colonias de Azotobacter aparecen después de 2 días de cultivo; son lisas, se extienden y se oscurecen al final del cultivo (8 días). Son comunes en suelos neutros y alcalinos (Fig. 5). Las colonias de Clostridium aparecen después de 3 días de cultivo, se reconocen fácilmente por la formación de burbujas de aire en el grano de suelo cubierto por la colonia de Azotobacter. Son comunes en suelos neutros (Fig. 5). Lecturas: - Cuente la cantidad de granos de suelo que tienen crecimiento (granos positivos). - Examine el tipo de microorganismos fijadores mediante la observación al microscopio de preparaciones teñidas con la técnica de Gram. Nota 1: En una colonia pueden coexistir ambos tipos de microorganismos. Nota 2: Para preparar el soporte y el medio de cultivo ver apéndice. REPORTE 1.-Porcentaje de granos de suelo con crecimiento de microorganismos fijadores asimbióticos de su suelo. 2.-Morfología microscópica y colonial de los mismos. 3.-¿Puede un suelo depender de la fijación asimbiótica como única fuente de nitrógeno? Explique ampliamente. 26 4.-Discusión y conclusiones BIBLIOGRAFÍA Frioni, L. 1990. Ecología Microbiana del Suelo. Universidad de la Repúbica. Montevideo, Uruguay. Frioni, L. 1999. Procesos Microbianos. Editorial de la Fundación Universidad Nacional de Río Cuarto, Argentina. Pochon, J. & Tardieux, Y. 1962. Techniques d´Analyse en Microbiologie du Sol. Editorial de la Tourelle, París. 27 FIJACIÓN DE NITRÓGENO: El nitrógeno es el mayor limitan te de la producción de las plantas Su reserva en el planeta no está en el suelo Son ciertos microorganismos los que lo incorporan directamente a las plantas o al suelo Fig. 4.- El esquema más simple del Ciclo del Nitrógeno. 28 Fig. 5.- Granos de suelo con y sin crecimiento de colonias de Azotobacter y Clostridium. 29 PRÁCTICA 8.- CICLO DEL NITRÓGENO: NITRÓGENO ORGÁNICO. MINERALIZACIÓN DEL INTRODUCCIÓN Uno de los grupos funcionales más importantes en los suelos es el de los microorganismos que mineralizan el nitrógeno orgánico. Estos pueden ser bacterias (aerobias y anaerobias), actinomicetos y hongos. Son importantes porque transforman el nitrógeno orgánico que no es asimilable por las plantas en nitrógeno mineral, asimilable. Este elemento, el N, es el mayor factor mineral limitante de la producción de las plantas. La mayor parte del nitrógeno que se encuentra en el suelo está en forma orgánica y proviene de la fijación de N2, de los tejidos animales y vegetales muertos, de los abonos verdes, etc. Si tomamos en cuenta solamente los restos microbianos, éstos provienen de poblaciones vivas, bacterias, hongos, protozoarios, nemátodos, etc. que en su conjunto pueden constituir más de 20 toneladas por hectárea. Las formas orgánicas complejas al mineralizarse liberan el nitrógeno en forma de amonio, por ello este proceso se conoce también con el término de Amonificación y a los microorganismos que participan se les llama amonificadores. OBJETIVO El alumno cuantificará la población del grupo funcional de microorganismos del suelo, que se encargan de mineralizar el N orgánico para hacerlo asimilable a las plantas. MATERIAL Tubos de ensaye de 150 X 17 mm con 10 ml de medio selectivo para amonificantes Gradilla para tubos Botellas de dilución con 90 ml de agua destilada estéril Pipetas sexológicas de 10 ml estériles Pipetas sexológicas de 1 ml estériles Suelo recién colectado y tamizado en malla de 2mm. Tubos de Kahn Balanza granataria Reactivo de Nessler. Cucharas de plástico Charolas para pesar suelo Papel de estraza Mecheros Bunsen Encendedor o cerillos Estufa 30 PROCEDIMIENTO -Pese 10 g de suelo y determine su humedad. -Con una segunda muestra de 10 g de suelo, haga diluciones desde 10-1 a 10-6 en botellas de dilución que contengan 90 ml de agua destilada estéril. -Inocule 3 tubos por dilución, conteniendo medio para amonificantes (con un aminoácido), colocando en cada tubo, 1 ml de cada dilución preparada. Incube a 28° C. -Después de 48 horas, según el tipo de suelo y la actividad buscada, determine la actividad microbiológica en cada uno de los tubos. Haga determinaciones cada 24 horas durante 10 días. LECTURAS: - Bajo condiciones de esterilidad, tome con una pipeta estéril, 1 ml de cada tubo inoculado con suelo. Coloque cada muestra en un tubo de Kahn. - Adicione 2 gotas de reactivo de Nessler. Un color naranja con turbidez, indica que la prueba es positiva. - Determine el número de organismos con actividad amonificante por gramo de suelo, utilizando las tablas de Mc Grady, localizadas en el apéndice. - Evalúe el proceso microbiano durante 10 días trazando curvas de actividad amonificante. Nota: Para la fórmula del medio de cultivo y las curvas vea el apéndice del Manual. REPORTE 1.- Número de microorganismos por gramo de suelo seco. 2.- Anexe una gráfica de la actividad amonificante de cada día elaborada en papel milimétrico. 31 3.- Calcule la pendiente de la curva e interprete la misma. 4.- Discusión y conclusiones BIBLIOGRAFÍA Pramer, D. y E. L. Schmidt. 1965. Experimental Soil Microbiology. Burgess Publishing Company, Minnesota. Pochon, J. & Tardieux, Y. 1962. Techniques d´Analyse en Microbiologie du Sol. Ed. de la Tourelle, París. Bloem, J., P. De Ruiter,& L. Bowman. 1997. Soil food webs and nutrient cycling in agroecosystems. In. J.D. Van Elsas, J.T., Trevors and E.M.H. Wellington (eds.). Modern Soil Microbiology. pp 245 - 278. Marcel Dekker, Inc. New York. 32 PRÁCTICA 9.- CICLO DEL FÓSFORO: SOLUBILIZACIÓN DEL FÓSFORO INSOLUBLE INTRODUCCIÓN El fósforo es un elemento esencial para los seres vivos, ya que es un constituyente estructural y funcional de todos los organismos. Se encuentra formando parte de los ácidos nucleicos, de los nucleótidos, de las proteínas, de los fosfolípidos, y en los procesos de acumulación y transporte de energía. En las plantas es también un constituyente de las fitinas (conocidas como inositol fosfatos) y es una parte importante de los abonos. El P se encuentra en todas partes de la biosfera. Las concentraciones normales de P total en los suelos minerales tienen en promedio 800 mg por kilo, mientras que en las aguas dulces hay un promedio de 0.02 mg por litro. En el suelo, el P se presenta bajo formas orgánicas y minerales. Las formas orgánicas representan del 15 al 80% del P total. En cuanto al P mineral, hay formas asimilables y no asimilables. Las formas asimilables, los iones PO4-3, están en la solución del suelo y adsorbidos en los coloides por intermedio de los cationes Ca+++, Fe+++ y Al+++. Los iones fosfato son cedidos a la solución del suelo a medida que son consumidos por las plantas. Las formas no asimilables del P son: fosfato tricálcico, hidroxiapatita y carbonato apatita. Las formas insolubles de P (fosfatos de calcio, aluminio y fierro) pueden ser solubilizadas por acción microbiana. En los suelos con pH alcalino se encuentra con frecuencia el P bajo forma insoluble. Muchos de los microorganismos solubilizadores del P son estimulados en su crecimiento cuando el pH del medio está entre 7.8 a 7.9. La solubilización microbiana de los minerales fosfatados puede hacerse directamente en el suelo y puede llevarse a cabo por producción de ácido o por producción de quelantes; en la rizosfera de las plantas ocurre una gran actividad solubilizadora de P. OBJETIVO El alumno demostrará la solubilización de una forma insoluble de P en el suelo por microorganismos del mismo. MATERIAL Suelo recién colectado y tamizado en malla de 2 mm Botellas de dilución con 90 ml de agua destilada estéril Pipetas serológicas de 10 ml estériles Pipetas serológicas de 1 ml estériles Cajas de Petri con Medio Mínimo Modificado Varillas de vidrio para siembra microbiológica Balanza granataria Cucharas de plástico Charolas para pesar suelo Mecheros Bunsen 33 Encendedor o cerillos Nota: Vea el Apéndice para consultar la fórmula del medio PROCEDIMIENTO -Pese 10 g de suelo y determine su humedad. -Con una segunda muestra de 10 g de suelo, haga diluciones de 10-3 a 10-6 en botellas de dilución que contengan 90 ml de agua destilada estéril. -Inocule 3 cajas Petri por dilución, conteniendo Medio Mínimo Modificado, colocando en cada caja 1 ml de cada dilución sobre el medio de cultivo. -Con la varilla de vidrio acodada, extienda uniformemente el inóculo. -Incube a 28° C durante una semana. LECTURAS - Observe las cajas Petri contra la luz buscando halos de disolución del fosfato dicálcico que contiene el medio de cultivo (Fig. 6). - Cuente el número de microorganismos solubilizadores de P por gramo de suelo. Para ello, eleccione la dilución en donde se pueden contar de 30 a 300 UFC. REPORTE - El número de microorganismos solubilizadores de P por gramo de su suelo de trabajo. Compare sus datos con los otros suelos de sus compañeros. - Cuente tanto el número de bacterias como de hongos con actividad solubilizadora (si domina uno u otro grupo de microorganismos, explique de acuerdo a las características fisicoquímicas de su suelo de trabajo). - Discusión y conclusiones. 34 BIBLIOGRAFÍA Ehrlich, H. L. 1996. Geomicrobiology. Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong. Dommergues, Y. y F. Mangenot. 1970. Ecologie Microbienne du Sol. Masson et Cie. Paris. Alexander, M. 1977. Introduction to Soil Microbiology. 2nd Ed. Wiley, New York. Reyes, I., L. Bernier, R. R. Simard, P. Tanguay & H. Antoun. 1999. Characteristics of phosphate solubilization by an isolate of a tropical Penicillium rugulosum and two UV-induced mutants. FEMS Microbiol. Ecol. 28: 291-295. Fig. 6.- Solubilización de Ca(PO4)2 por una bacteria del suelo. 35 PRÁCTICA 10. OXIDACIÓN DE AZUFRE REDUCIDO. INTRODUCCIÓN La mayor parte del S del suelo se encuentra bajo forma orgánica. El azufre mineral se encuentra en los suelos aireados bajo forma de sulfato; en los suelos mal aireados, bajo forma de sulfuro. El mismo proviene, aunque en bajas cantidades, de la roca madre y sobre todo de las prácticas agrícolas como fertilizante y de la industria (SO2). Hay cultivos, como la caña de azúcar, que requieren anualmente 100 kg de S por hectárea. Todas estas formas son metabolizadas microbiológicamente en el suelo. La oxidación completa del S es un proceso bacteriano llevado a cabo por bacterias autótrofas, aerobias, que son capaces de oxidar el azufre elemental a sulfatos. La oxidación parcial se lleva a cabo por diferentes microorganismos heterótrofos y el azufre lo oxidan a hiposulfitos; la oxidación de los hiposulfitos a politionatos y sulfatos la conducen tanto microorganismos autótrofos como heterótrofos. Las transformaciones de S por los microorganismos conducen a la formación geológica de depósitos de azufre y sulfuros, también a la corrosión del Fe y a la destrucción del concreto, así como a la acumulación de ácido en las tuberías de drenaje de las minas y en los suelos. OBJETIVO El alumno evaluará la formación de ácido en el suelo por microorganismos cuando oxidan S elemental a sulfatos previa adición del mismo al suelo y determinará el número de microorganismos con actividad de oxidación de S. MATERIAL Suelo recién colectado y tamizado en malla Flor de azufre de 2 mm HCl S elemental Solución acuosa de BaCl2 al 5% Balanza Balanza granataria Potenciómetro Cucharas de plástico Tubos de ensaye de 150 X 17 mm con 10 Charolas para pesar suelo ml de medio selectivo para oxidadores de S Papel estrasa Botellas de dilución con 90 ml de agua Mecheros Bunsen destilada estéril Encendedor o cerillos Pipetas de 10 ml estériles Glucosa Matraces Erlenmeyer de 250 ml Pipetas de 1 ml estériles Tubos de Kahn Nota: Vea el apéndice para consultar la fórmula del medio de cultivo. PROCEDIMIENTO Y LECTURAS 36 A) Ensayo No. 1 -Pese 10 g de suelo y determine su humedad. -Con una segunda muestra de 10 g de suelo, haga diluciones desde 10-1 a 10-6 en botellas de dilución que contengan 90 ml de agua destilada estéril. -Inocule con 1 ml de cada una de las diluciones, 3 tubos por dilución, conteniendo medio para oxidadores de S elemental, colocando en cada tubo, 1 ml de cada dilución preparada. Incube a 28° C. -Después de 2 a 3 semanas de incubación, según el tipo de suelo, determine la actividad microbiológica en cada uno de los tubos, de la siguiente manera: - Tome de cada tubo, sin agitar el mismo, de 1 a 2 ml del líquido transparente y coloquelo en un tubo de Kahn. - Adicione a la muestra: 2 gotas de HCl + 5 gotas de una solución de BaCl2 al 5%. - Observe la precipitación del sulfato. Compare siempre con un testigo. -Para determinar el número de organismos con actividad oxidante de S por gramo de suelo, utilice las tablas de Mc Grady, localizadas en el apéndice. B) Ensayo No. 2 -Pese 3 muestras de 100 g de suelo cada una, coloque cada muestra en matraces Erlenmeyer de 250 ml. Trate el suelo de la siguiente manera: Matraz 1. Suelo + 0.5 g de azufre elemental Matraz 2. Suelo + 0.5 g de azufre elemental + glucosa Matraz 3. Suelo sin tratar - Incube a 28oC durante 2 semanas - Mezcle bien el contenido de cada matraz, tome 10 g, haga una suspensión 1:2 con agua y mida el pH. 37 REPORTE - El número de microorganismos aerobios que oxidan el S por gramo de su suelo de trabajo. Compare sus datos con los otros suelos de sus compañeros. - Los valores de pH del suelo sin adicionar S y con adición del mismo elemento. - Si la actividad de oxidación del S es mayor en un suelo que en otro, explique. - Discusión y conclusiones. BIBLIOGRAFÍA Ehrlich, H. L. 1996. Geomicrobiology. Marcel Dekker, Inc., New York. Dommergues, Y. & F. Mangenot. 1970. Ecologie Microbienne du Sol. Masson et Cie. Paris. Alexander, M. 1977. Introduction to Soil Microbiology. 2nd Ed. Wiley, New York. 38 UNIDAD III. INTERACCIÓN MICROORGANISMO-PLANTA PRÁCTICA 11. PRODUCCIÓN DE AUXINAS POR Azospirillum ASOCIADO A UNA PLANTA GRAMÍNEA. INTRODUCCIÓN Azospirillum es un bacilo curvo Gram negativo, es extremadamente móvil en medio semisólido y líquido. Posee un flagelo polar que utiliza para su locomoción y numerosos flagelos laterales de longitud corta. Azospirillum es típicamente un organismo aerobio cuando se le suministra una fuente combinada de nitrógeno y posee la capacidad de utilizar el oxígeno y el nitrato como último aceptor de electrones. Bajo condiciones de microaerofilia, puede fijar nitrógeno atmosférico. Azospirillum se ha aislado generalmente de rizósfera y raíces de pastos forrajeros y cereales de diversas regiones geográficas, con una mayor frecuencia en regiones tropicales que en templadas. Azospirillum también ha sido aislado a partir de plantas no gramíneas tales como el camote (Ipomea batatas) y de leguminosas forrajeras (Lotus corniculatus), así como de cactáceas de los géneros Opuntia y Stenocereus. Cuando Azospirillum se encuentra asociado a la planta, su aporte de nitrógeno es bastante discreto y poco significativo. Sin embargo, la mayor aportación que hace este microorganismo en dicha asociación es la referida a la producción de ácido indol acético, sustancia reguladora del crecimiento vegetal, por lo que en muchos países es utilizado en la Agricultura con resultados positivos. Por ello es una de las bacterias que se producen industrialmente en la elaboración de inoculantes. Al inducir la ramificación y producción de pelos absorbentes en las raíces, se incrementa la absorción de nutrientes y de agua. OBJETIVO El alumno analizará el efecto del Azospirillum in vitro en la inducción de la ramificación de la radícula de una plántula de maíz. MATERIAL Microscopio compuesto y estereoscópico Cámara de Petroff-Hauser Portaobjetos y cubreobjetos Cultivo de Azospirillum brasilense Pipetas de 1 y 10 ml estériles Agua destilada estéril Cajas Petri con agar agua Probeta de 250 ml Matraces Erlenmeyer de 125 ml con tapón de hule Medio de cultivo para Azospirillum Solución NaCl2O3 3:10 ó Solución de HgCl2 1:1000 Papel seda CH3CH2OH de 96º Aceite de inmersión Semillas de maíz Pinzas de disección, Bistur Incubadora a 28ºC 39 Frascos de vidrio de boca ancha Vidrios de reloj PROCEDIMIENTO Producción del inóculo: Prepare el medio de cultivo para Azospirillum. Inocule este medio con la cepa de Azospirillum brasiliense, cuente el número de células por ml en la cámara de Petroff-Hauser, posteriormente ajuste el número de células a 106cel/ml, e inocule las plántulas de maíz. Germinación de semillas: - Coloque algunas semillas de maíz a estudiar en un matraz Erlenmeyer de 125 ml con tapón de hule. -Cubra las semillas con una solución acuosa de HgCl2 1:1000. -Agite bien para que la superficie del frasco y el tapón se desinfecten también. - Deje actuar el HgCl2 por 2 a 5 minutos según el tamaño de la semilla. Después de este momento se debe trabajar asépticamente. -Lave la semilla con agua destilada estéril por lo menos 8 veces. Decante cada enjuague en el frasco de vidrio de boca ancha. - Ponga a germinar las semillas desinfectadas en cajas de Petri con agar-agua. Una semilla por caja. - Las semillas se dejan germinar en incubadora a 28oC. Inoculación de las plantas: - Cuando la radícula alcance unos 3 cm, inocule cada una con 0.5 ml del cultivo de 48 horas de Azospirillum y manténgalas en la incubadora. - Conserve semillas germinadas testigo (sin inocular). Lectura de resultados: - A los 2 días de incubación, coseche las plántulas. - Observe en el esteromicroscopio la ramificación de las raicillas y la formación de pelos radiculares comparando con los testigos. Para ello, corte las radículas en pedazos de 2 a 5 cm y colóquelas en un vidrio de reloj con agua. 40 - Mida el volumen de las raíces con una probeta. REPORTE 1.- ¿La cepa de Azospirillum brasilense que probó produce AIA? 2.- ¿Cómo demostró la producción de AIA? 3.- Explique ampliamente el efecto que tiene el AIA sobre la planta. 4.- Discusión y conclusiones BIBLIOGRAFÍA Mascarua-Esparza, M.A., Villa-González, R. and Caballero-Mellado, J.. 1988. Acetylene reduction and indolacetic acid production by Azospirillum isolates. Plant and Soil. 106: 91-95. Okon, Y. and J. Vanderleyden. 1997. Root-associated Azospirillum species can stimulate plants. ASM News 63: 366-369. 41 PRÁCTICA 12. SIMBIOSIS Rhizobium LEGUMINOSAS. Y Bradyrhizobium CON PLANTAS INTRODUCCIÓN Los miembros de los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium infectan las raíces de las plantas leguminosas formando nódulos, en donde se lleva a cabo la fijación simbiótica del nitrógeno. La bacteria en cultivo es un bacilo corto Gram negativo, no forma esporas, es aerobio, mide 0.5 micras de diámetro por 1.2 a 3.0 micras de largo. Los representantes de este género son típicamente móviles en cultivo joven. Dentro del nódulo, los rizobios presentan pleomorfismo y se les llama bacteroides. Bajo esta forma en algunas ocasiones aumentan su tamaño hasta 10 veces. Rhizobium y Bradyrhizobium están clasificados junto con Agrobacterium y Phyllobacterium en la familia Rhizobiaceae. Las plantas leguminosas cuando están noduladas efectivamente, fijan cantidades apreciables de nitrógeno, traduciéndose en un mantenimiento y a veces aumento de la fertilidad del suelo (Fig. 7). OBJETIVOS -El estudiante experimentará la técnica de aislamiento de Rhizobium y Bradyrhizobium a partir de nódulos de raíces de plantas leguminosas. -El estudiante diferenciará las características microscópicas de Rhizobium en forma de bacteroide, así como las características microscópicas y coloniales de los rizobios. -El estudiante obtendrá plantas leguminosas noduladas con Rhizobium en cultivos monoxénicos. MATERIAL Tubos con tapón de rosca 16X130, estériles Gradilla para tubos Pipetas serológicas de 5 ml Solución de HgCl2 1:1000 Varilla de vidrio estéril Agua destilada estéril. Placas con medio ALM, unas con Rojo Congo y otras con Azul de Bromotimol Tubos de 16X150, con tapón de rosca, con solución nutritiva-N-agar blando sembrados con semillas de trébol Microscopio compuesto Papel seda Papel estrasa Tijeras Mechero Bunsen Equipo de coloración Gram CH3CH2OH de 96º Asa microbiológica Encendedor o cerillos Plantas leguminosas con nódulos radicales 42 Tubos de 16X150, con tapón de rosca, con solución nutritiva completa-agar blando, sembrados con semillas de trébol Portaobjetos Suspensión bacteriana de Rhizobium leguminosarum bv. trifolii PROCEDIMIENTO Aislamiento - Lave las raíces, abundantemente con agua de la llave. De las mismas, desprenda los nódulos sin lesionarlos, dejando una porción de raíz de cada lado del nódulo. Dentro de un tubo de ensayo sumerja un sólo nódulo en HgCl2 1:1000, durante 1 a 3 minutos, según el tamaño. -A partir de este momento, trabaje en condiciones asépticas. -Dentro del mismo tubo, lave con agua estéril por lo menos 5 veces para eliminar totalmente el antiséptico. Triture el nódulo desinfectado con una varilla de vidrio estéril dentro del tubo donde se desinfectó. -Del triturado del nódulo tome una asada para hacer un frotis que se colorea con la técnica de Gram para la observación de la forma bacteroide. -Del mismo triturado tome otra asada que se siembra por estría cruzada sobre el medio de Agar-Levadura-Manitol (ALM ) con indicador Rojo Congo y otra, sobre el medio que lleva el indicador Azul de Bromotimol. -Incube a 28ºC por 2 días para los rizobios de crecimiento rápido (Rhizobium) y de 6 a 8 días para los de crecimiento lento (Bradyrhizobium). - Observe la morfología colonial en el medio de cultivo que lleva Rojo Congo (los rizobios no absorben el colorante), así como la modificación del pH original, en el medio con azul de bromotimol. - Haga un frotis de las colonias y tíñalo con la técnica de Gram. Obtención del cultivo monoxénico leguminosa-Rhizobium - Una vez que las semillas de trébol han germinado y las plántulas han alcanzado un mínimo de 1 cm de altura, inocule cada planta con 0.2 ml de la suspensión bacteriana que se le proporcione, de la siguiente forma: Tubos con solución nutritiva completa: inocular un tubo y el otro dejarlo sin inocular. Tubos con solución nutritiva sin nitrógeno: inocular un tubo y otro dejarlo sin inocular. 43 Incube los tubos con iluminación (fotoperiodo de 12/12), a 28º C, por un mes; realice observaciones dos veces a la semana. REPORTE 1.- Observaciones microscópicas de bacteria y bacteroide (Incluya esquemas). 2.- Morfología colonial en ALM-Rojo Congo y en ALM-Azul de Bromotimol (recuerde que debe incluir cambios en el medio). 3.- Observaciones macroscópicas del cultivo leguminosa-Rhizobium. 4.-Discusión y conclusiones 44 BIBLIOGRAFÍA CIAT-UNDP. 1987. Simbiosis Leguminosa-Rizobio. Manual de Métodos de Evaluación, Selección y Manejo. CIAT. Cali. Somasegaran, P. & Hoben, H.J. 1985. Methods in Legume Rhizobium Technology. NIFTAL & MIRCEN, Hawaii. Spaink, H., A. Kondorosi and P.J.J. Hooykaas, Eds. 1998. The Rhizobiaceae. Kluwer Academic Publishers, Holanda. Fig. 7.- Nódulos y bacteroides de Rhizobium leguminosarum biovar viciae. 45 PRÁCTICA 13. SIMBIOSIS Frankia-PLANTAS ACTINORRÍZICAS. INTRODUCCIÓN La primera descripción de nódulos radicales fijadores de nitrógeno atmosférico en plantas no leguminosas data desde 1866 y fue hecha en el árbol Alnus glutinosa (Fig. 8) Los árboles y arbustos que forman nódulos radicales en asociación con Frankia, son conocidos como plantas actinorrízicas pues este microorganismo fijador de nitrógeno molecular es un actinomiceto. Se conocen 25 géneros de plantas actinorrízicas los cuales pertenecen a ocho diferentes familias botánicas. Algunas de estas familias son: Betulaceae, Casuarinaceae, Myricaceae, Rhamnaceae y Rosaceae. La mayoría son capaces de fijar altas cantidades de nitrógeno atmosférico, por ejemplo, Casuarina littoralis puede fijar el equivalente a 290 Kg de N/ha/año. Aunque estas plantas son taxonómicamente muy diversas, tienen en común el ser perennes, leñosas y pioneras en suelos marginales. Algunas de estas plantas producen madera de buena calidad, leña de alto valor calorífico, estabilizan dunas, son buenas cortinas rompevientos, se usan en reforestación urbana y rural, etc. En México existe un buen número de ellas, las más conocidas son Casuarina y Alnus (elite o aile), plantas de múltiples usos en nuestro país. La bacteria que se encuentra dentro de los nódulos, se logró cultivar en 1978, aunque hasta la fecha no se ha logrado el cultivo de las Frankia de todas las especies vegetales que se conocen como portadoras de nódulos. Frankia es una bacteria Gram positiva, filamentosa y con estructuras típicas: esporangios multiloculares y vesículas. En estas últimas se encuentra la enzima nitrogenasa que es la responsable de la fijación del nitrógeno atmosférico. OBJETIVO El estudiante analizará el efecto que ejerce la asociación de algunos árboles con el actinomiceto fijador de nitrógeno, Frankia. También identificará a la bacteria en cultivo puro, así como dentro de las células corticales de los nódulos. MATERIAL Microscopio compuesto Microscopio estereoscópico Portaobjetos Cubreobjetos Pipetas Pasteur estériles CH3-CH2OH de 96º Papel seda Tijeras Mechero Bunsen Encendedor o cerillos Frasco gotero con solución de azul de algodón al 1% Navajas nuevas de afeitar (doble filo) Empaque de unicel Plantas de aile o de casuarina con y sin nódulos radicales Cultivo puro líquido de Frankia Vidrios de reloj 46 PROCEDIMIENTO - Tome una gota de un cultivo puro líquido de Frankia y colóquela entre porta y cubreobjetos. - Observe al microscopio la morfología de las microcolonias con el objetivo: 10X, y la morfología de las vesículas y esporangios con el objetivo: 100X. - Observe y analice los ejemplares de plantas de aile inoculados y sin inocular. - Tome un lóbulo de un nódulo de aile (Alnus). Colóquelo entre dos pedazos de empaque de unicel. - Coloque la unidad (lóbulo y empaque) firmemente entre el índice y el pulgar de la mano izquierda. - Haga varios cortes transversales finos con una navaja de afeitar y colóquelos en un vidrio de reloj con agua. - Seleccione los cortes más finos, procure que sean del mismo grosor, y colóquelos entre porta y cubreobjetos, adicione una gota de azul de algodón. - Observe al microscopio (objetivos 10X y 40X) REPORTE 1.-Describa la morfología microscópica de Frankia en cultivo puro. Dibuje las diferentes estructuras características de la bacteria. 2.-Dibuje un corte transversal de un nódulo actinorrízico y describa sus partes. Describa las vesículas y las células radicales donde se alojan. 3.- Escriba las observaciones que haya efectuado sobre los arbolitos inoculados y sin inocular. 47 4.-Discusión y conclusiones BIBLIOGRAFÍA Dommergues, Y., E. Duhoux et Diem, H.G. 1999. Les arbres fixateurs d´azote. CIRAD. Editions Espaces 34, FAO, IRD, París, Francia. Schwintzer, C.R. y Tjepkema, J.D. 1990. The Biology of Frankia and Actinorrhizal Plants. Academic Press, Inc., New York. Valdés, M. 2003. Frankia Ecology. In: K. Kowlowsky y W.E. Newton (Eds.). Actinorrhizal Simbiosis. Kluwer Academic Publishers, Holanda. Valdés, M. 2003. La bacteria filamentosa Frankia. In: Microbios en Línea. J. y E. MartínezRomero (Eds.). DGTA/UNAM, México. Foto: Luis Vásquez Fig.8. Filamentos, vesículas y esporangios de la bacteria Frankia. 48 PRÁCTICA 14. ECTOMICORRIZAS INTRODUCCIÓN El término micorriza significa literalmente hongo-raíz y se refiere a una estructura radical resultado de la asociación entre los pelos radicales de una planta y hongos específicos del suelo. Casi todas las plantas forman micorriza y existen diversos tipos de esta asociación, las más distribuídas en la naturaleza son la ectomicorriza y la endomicorriza o micorriza arbuscular (MA). La primera es visible a simple vista, basta con observar la deformación de las raicillas; mientras que para observar la MA es necesario hidrolizar las raicillas, teñirlas y examinarlas al microscopio para observar los arbúsculos que todos los hongos de este tipo forman, así como las vesículas que algunos de ellos presentan. La ectomicorriza (Fig. 9), está presente en árboles de la familia Pinaceae (pino, abeto, alerce), Fagaceae (roble, castaño), Betulaceae (aile, aliso o elite, abedul). Salicaceae (chopo), Juglandaceae (nogal), Myrtaceae (eucalipto), etc. Los hongos que forman este tipo de micorriza son diversos Ascomicetos y Basidiomicetos, muy abundantes en los bosques de pinos en la época de lluvias. OBJETIVO El estudiante analizará las bases para distinguir las ectomicorrizas formadas en plántulas de pino por diferentes hongos. MATERIAL Plántulas de pino con ectomicorrizas, de vivero Plántulas de pino, inoculadas y sin inocular, cultivadas en bolsas de crecimiento o en maceta Cultivo de hongos ectomicorrícicos Estereomicroscopio Porta y cubreobjetos Navaja nueva de afeitar de doble filo Frasco gotero con solución de azul de algodón al 1% Pipetas Pasteur Trozo de unicel Aguja de disección Vidrio de reloj Microscopio compuesto CH3CH2OH del 96º Papel seda PROCEDIMIENTO 1.- Lave abundantemente las raíces con agua de la llave. A simple vista, observe el color de las diferentes micorrizas de una sola raíz, así como la diferente morfología de las mismas (bifurcada, pinada coraloide, etc.). -Observe con el estereomicroscopio los diferentes tipos de ectomicorriza. -Separe una muestra de ectomicorriza y colóquela entre dos pedazos de unicel. 49 -Coloque la unidad (micorriza y empaque) firmemente entre los dedos índice, pulgar y medio de su mano izquierda. -Haga 20 cortes transversales finos con una navaja nueva de afeitar. Póngalos en un vidrio de reloj con agua. -Coloque los cortes más finos entre porta y cubreobjetos. Procure que sean del mismo grosor, agregue una gota de azul de algodón. -Observe al microscopio a 10X y 40X. 2.- Observe las raíces de las plantas inoculadas y sin inocular, realice observaciones al estereomicroscopio. En caso de que encuentre ectomicorrizas, determine cuál es su morfotipo. REPORTE 1- Describa los morfotipos de las diferentes micorrizas presentes en la raíz estudiada. 2.- Morfología microscópica de un hongo ectomicorrícico (Basidiomiceto). 3.- Géneros de algunos hongos ectomicorrícicos. 4.- Describa las observaciones hechas en los pinos inoculados y sin inocular, cultivados en bolsas de crecimiento o en maceta. 50 5.- Discusión y conclusiones BIBLIOGRAFÍA Brundett, M., Bougher, N., Dell, B., Grove, T. and Malajczuk, N. 1996. Working with mycorrhizas in foresty and agriculture. ACIAR Monograph 32, Canberra, Australia. Ingleby, K., Mason, P.A., Last, F.T. y Fleming, L.V. 1990. Identification of Ectomycorrhizas. Institute of Terrestrial Ecology. HMSO, London. Landis, T.D., Tinus, R.W., McDonald, S.E. y Barnett, J.P. 1990. The Biological Component: Nursery Pest and Mycorrhizae. In: Forest Service. Tree Nursery Manual, Vol. 5. Agriculture Handbook 674. U.S Departament of Agriculture, Corvallis, Oregon. Vogt, K., H. Asbjornsen, A. Ercelawn, F. Montagnini and M. Valdés. 1997. Roots and mycorrhizas in plantation ecosystems. In: Management of soil, nutrients and water in tropical plantation forests. ACIAR/CSIRO/CIFOR, Canberra, Australia. 51 Fig. 9.- Ectomicorriza en Angiospermas y Gimnospermas (Brundett et al, 1996). 52 PRÁCTICA 15. ENDOMICORRIZAS INTRODUCCIÓN La MA (Fig. 10),es el tipo de micorriza más ampliamente distribuida y está presente en la mayoría de las plantas cultivadas tales como: cereales, papas, frijoles, soya, tomate; en la mayoría de los árboles frutales como cítricos, perales, manzano, parra, almendro; en muchos árboles de importancia forestal como el arce, caoba, fresno, liquidámbar y en las hortalizas como cebollas, poro, espinacas. También los pastos, las plantas herbáceas y los cactos forman MA. Los hongos formadores de este tipo de micorriza pertenecen al orden Glomeromycota, familias Gigasporaceae, Acaulosporaceae y Glomaceae. Los hongos micorrízicos benefician a las plantas hospederas en diversas formas, algunas de ellas son: incremento de la longevidad de los pelos radicales, incremento del área de absorción, incremento de la absorción de nutrientes tanto mayores como menores (sobre todo fósforo, potasio, cobre y zinc) y tolerancia a condiciones adversas. OBJETIVO El estudiante demostrará la presencia de micorriza arbuscular en raíces de plantas de interés agronómico, así como la presencia en el suelo de esporas de este tipo de hongos. MATERIAL Raicillas de diferentes plantas Muestras de suelo fresco Vasos de precipitado de 1000 ml Matraces Erlenmeyer de 125 ml Cajas de Petri Agujas de disección Porta y cubreobjetos excavados Viales de vidrio de 5-10 ml Estereomicroscopio Microscopio compuesto Plancha caliente Juego de tamices de > 250 mm a 0.177 mm Balanza granataria Soporte universal con anillos de fierro Embudo de vidrio tallo corto de 26 cm de diámetro. Palillos de madera Papel filtro Tijeras Pipetas serológicas de 5 ml Pisetas Embudos de porcelana de 10 cm de diámetro Solución de KOH al 10% Solución de HCl 1N Fucsina ácida en lactoglicerol al 0.01% PROCEDIMIENTO Procesamiento de raíces para ver micorrización: -Lave abundantemente las raíces con agua de la llave para eliminar el suelo adherido. 53 -Corte las raicillas tiernas en pedazos de 1 cm en una caja Petri. -Coloque las raicillas en los viales y cúbralas con la solución de KOH. -Caliente el vial en placa a 90 ºC, por 10 a 15 minutos o hasta que las raicillas liberen los pigmentos y estén blandas. -Elimine el KOH, lave de 2-3 veces con agua de la llave y acidifique con la solución de HCl, agite de 5 a 10 minutos, para que su pH baje entre 2.5 y 3.0, para ello, agite el contenido del vial durante 10 minutos. Este paso de acidificación es importante para que haya una buena coloración. -Elimine el HCl. NO lave con agua -Cubra las raicillas con el colorante y caliente en placa a 90ºC por un período de 10 minutos. -Monte 20 raicillas en un portaobjetos en forma vertical, paralelas unas a las otras. -Después de colocar el cubreobjetos, cubra con un papel absorbente y con un pedazo de madera presione uniformemente para aplastar las raicillas. Cuide que no se formen burbujas de aire. -Observe al microscopio a 100X para identificar las estructuras fúngicas: hifas, arbúsculos, esporas y vesículas. -Haga la estimación del porcentaje de colonización revisando 3 campos equidistantes por cada segmento de raíz (ver esquema en la página siguiente). -Cuando un pedazo de raíz pasa por el campo óptico del microscopio y tiene alguna estructura fúngica de micorriza arbuscular, se le da valor igual a 1 CÁLCULOS Número de puntos colonizados Porcentaje de colonización = Número total de puntos observados 54 Inicio Esquema de observación al microscopio de raíces endomicorrizadas teñidas. Procesamiento de suelo para extraer esporas de hongos MA: -Coloque 100 g de suelo en un vaso de precipitados de 1000 ml. Agregue 150 ml de solución de hexametafosfato de sodio al 5% y lleve a 1000 ml con agua de la llave, mezcle perfectamente deshaciendo todos los terrones; decante. Tamice primero con malla de 2 mm y después con malla de 0.177 mm (Fig. 11). -Con el chorro de agua de una piseta baje las esporas (también habrá material orgánico y mineral del suelo) del tamiz de abertura pequeña y vacíe sobre un papel filtro circular colocado en un embudo de porcelana. Para hacer la observación al estereomicroscopio, coloque el papel filtro en la tapa de una caja de Petri. -Busque al estereomicroscopio las esporas de los hongos MA. -Con la ayuda de un palillo de madera o de un pincel fino, tome las esporas y colóquelas sobre un portaobjetos para observarlas al microscopio (10X). Las esporas fracturadas muestran mejor sus paredes (recuerde que el análisis murámico es la base para la identificación taxonómica de estos hongos). REPORTE 1.-Esquematice las estructuras fúngicas de la micorriza arbuscular observadas en el interior y exterior de las raicillas. 55 2.-Morfología de las esporas de los hongos MA. 3.-¿Cómo diferenció las estructuras de los hongos MA de la de otros hongos que pueden también ser habitantes radicales y que no son micorrizicos? 4.- Mencione algunos géneros pertenecientes al orden Glomales. 5.- Discusión y conclusiones BIBLIOGRAFÍA Brundett, M., Bougher, N., Dell, B., Grove, T. and Malajczuk, N. 1996. Working with mycorrhizas in foresty and agriculture . ACIAR Monograph 32, Canberra, Australia. Sieverding, E. 1991. Vesicular-Arbuscular Management in tropical ecosystems. D.G.T.Z. Eschborn, Alemania. Norris, J.R., D. J. Read and A.K. Varma, Eds. 1992. Methods in Microbiology. Volume 24 Techniques for the study of mycorrhiza. Academic Press. New York. Gianinazzi, S. and H. Schüepp, Eds. 1994. Impact of arbuscular mycorrhizas on sustainable agriculture and natural ecosystems. Birkhäuser Verlag, Basilea, Suiza. 56 Fig. 10.- Micorriza arbuscular (Brundett et al., 1996). 57 Fig. 11.- Procedimiento para la extracción de esporas de hongos MA, de muestras de suelo. 58 APÉNDICE CÁLCULO DEL NÚMERO MAS PROBABLE DE BACTERIAS POR EL MÉTODO DE Mc GRADY La lectura de los resultados consiste en contar para cada dilución el número de tubos positivos que implican crecimiento. Se debe admitir que la presencia de un microorganismo viable en el inóculo es necesario y suficiente para que haya tal crecimiento. La determinación del número más probable de microorganismos se deduce del número de tubos positivos encontrados para las diluciones consecutivas. 1.-Orden de los resultados.- Hacer un cuadro indicando, para cada dilución, el número de tubos positivos. Se dan cuatro ejemplos. 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 Ejemplo I Para 3 tubos/dil 3 3 3 2 1 0 0 0 Ejemplo II Para 5 tubos/dil 5 3 2 0 0 0 0 0 Ejemplo III Para 5 tubos/dil 5 5 5 5 3 2 2 0 Ejemplo IV Para 5 tubos/dil 2 1 2 0 0 0 0 0 2.-Determinación del número característico (3 cifras). La última dilución (de izquierda a derecha), donde todos los tubos son positivos, será la primera cifra del número característico; los dos siguientes son aquellos del número de tubos positivos para cada una de las dos diluciones siguientes. Para los siguientes ejemplos tenemos: Ejemplo I = 321 para la dilución 10-3 Ejemplo II = 532 para la dilución 10-1 Ejemplo III = 532 para la dilución 10-4 Ejemplo IV = 212 para la dilución 10-1 3.-Determinación del número más probable de microorganismos. Existe para cada número de repeticiones, una tabla que da el número más probable de microorganismos contenidos en el volumen del inóculo de acuerdo a la dilución correspondiente y al número característico. Para los mismos ejemplos admitiendo que la inoculación se hizo con 1 ml: Ejemplo I Ejemplo II Ejemplo III Ejemplo IV 15.0 microorganismos en 1 ml de la dilución 10-3 14.0 microorganismos en 1 ml de la dilución 10-1 14.0 microorganismos en 1 ml de la dilución 10-4 1.2 microorganismos en 1 ml de la dilución 10-1 59 Se lleva enseguida a 1g de suelo, dividiendo por el volumen en ml de inóculo y multiplicando por el inverso del valor absoluto del exponente de la dilución considerada. Resultados para los mismos ejemplos: Ejemplo I Ejemplo II Ejemplo III Ejemplo IV = 15.0 X 103 = 14.0 X 101 = 14.0 X 104 = 1.2 X 101 = = = = 15 000/g de suelo 140/g de suelo 140 000/g de suelo 12/g de suelo Trazado de las curvas de actividad biológica 1.-Orden de los resultados. Se opera igual que para la determinación del NMP, anotando el número de tubos + y +; cada + se cuenta por 1 y cada + por 0.5 para cada dilución. El ejemplo siguiente es para tres tubos por dilución. 10-1 10-2 Después de: 1día 2 3 4 5 6 7 9 12 15 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 10-3 10-4 10-5 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ + +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ + +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 10-6 10-7 10-8 ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 60 2.-Cálculo de la dilución media. Se calcula, para cada día el índice de la dilución media límite, que se expresa así: 78 Número total de los tubos positivos IDM = Número de tubos inoculados por dilución Ejemplo precedente: Tiempo de la lectura (días) Índice de la dilución media 1 0 2 - 6.0/3 = -2 3 - 10.5/3 = -4.5 4 - 17.0/3 = -5.3 5 - 18.0/3 = -6.0 7 - 18.0/3 = -6.0 9 - 18.0/3 = -6.0 12 - 18.0/3 = -6.0 15 - 18.0/3 = -6.0 61 3.-Transcripción gráfica. La curva siguiente se hace en papel milimétrico colocando en las abcisas los días y en las ordenadas, los índices de dilución. Por regla general entre más acentuada es la pendiente inicial de la curva y más grande es la dilución final, más activo es el grupo funcional de microorganismos. TABLAS DE Mc GRADY 3 tubos /dilución Número Característico Número de Microorganismos Número Característico 000 001 010 011 020 100 101 102 110 111 120 121 130 200 201 202 210 211 212 220 221 0.0 0.3 0.3 0.6 0.6 0.4 0.7 1.1 0.7 1.1 1.1 1.5 1.6 0.9 1.4 2.0 1.5 2.0 3.0 2.0 3.0 222 223 230 231 232 300 301 302 310 311 312 313 320 321 322 323 330 331 332 333 Número de Microorganismos 3.5 4.0 3.0 3.5 4.0 2.5 4.0 6.5 4.5 7.5 11.5 16.0 9.5 15.0 20.0 30.0 25.0 45.0 110.0 140.0 Práctica N. 4 Soluciones para la determinación de materia orgánica del suelo 1. K2Cr2O7 1N. Se disuelven 49.025 g de K2Cr2O7 QP en agua destilada, aforar a 1000 ml. 2. FeSO4.7H2O 1N. Disolver 278 g de FeSO4.7H2O QP en agua destilada, agregar 15 ml de H2SO4 concentrado y aforar a 1000 ml. 3. Indicador de difenilamina. Disolver 0.5 g de difenilamina en 20 ml de agua y 100 ml de H2SO4 concentrado. 62 Práctica No.5 Soluciones para la determinación de la capacidad de intercambio catiónico total. 1. Solución de CaCl2 1N pH 7.- Pesar 109.5 g de CaCl2. 6H2O o 73.5 g de CaCl2.2H2O, aforar a 1000 ml con agua destilada libre de CO2 y ajustar el pH a 7 con Ca(OH)2. 2. Solución de NaCl 1N pH 7.- Disolver 58.5 g de NaCl en un poco de agua destilada y aforar a 1000 ml. 3. Solución de EDTA (versenato).- Disolver 20 g de EDTA deshidratado (secado en un desecador) en 900 ml de agua destilada en la que previamente se disolvieron 0.39 g de MgCl2.6H2O y aforar a 1000 ml con agua destilada. Esta solución es 0.1 N y debe guardarse en un frasco de polietileno ya que su título cambia en frasco de vidrio. 4. Solución amortiguadora pH 10.- Disolver 67.5 g de NH4Cl en 200 ml de agua destilada, adicionar 570 ml de NH4OH concentrado y diluir con agua destilada a 1000 ml. 5. Solución de clorhidrato de hidroxilamina.- Disolver 4 g de NH2OH-HCl en 100 ml de agua destilada. 6. Solución de cianuro de potasio al 2 %.- Disolver 2 g de KCN en 100 ml de agua destilada. 7. Solución indicadora de negro de eriocromo T.- Disolver 0.5 g de eriocromo T y 4.5 g de NH2OH-HCl en 100 ml de alcohol metílico. Preparar una solución nueva cada 3 semanas. 8. Solución estándar de calcio.- Disolver 0.5005 g de CaCO3 grado reactivo y secado a 150ºC en 5 ml de solución de HCl 6N; esta solución es 0.01 N. Práctica No.6 Rosa de Bengala Fenólico Rosa de Bengala CaCl2 1.0 g 0.3 g Agregar estas dos sustancias a 100 ml de una solución acuosa de fenol al 5%. Práctica No.7 Preparación de silicagel: A.B.- Acido clorhídrico d= 1.19 Agua destilada Silicato de sodio d= 1.32 Agua destilada 61 ml 39 ml 18 ml 82 ml Mezclar volumenes iguales, se vierte el silicato de sodio en el ácido clorhídrico (mezclar B en A) agitar y repartir 30 ml por cada caja Petri. Dejar solidificar (2-3 h). Dializar con agua de la llave hasta pH 7.0 (12-24 h) colocando las cajas sin tapa en una charola donde el agua de la llave corra. Impregnación del gel.- Impregnar las placas con 2 ml del medio siguiente: Solución salina de Winogradsky Carbonato de calcio Glucosa 100.0 ml 20.0 g 20.0 g 63 Preparación de la solución salina de Winogradsky: K2HPO4 MgSO4.7H2O NaCl MnSO4.H2O Fe2(SO4)3 5.0 g 2.5 g 2.5 g 0.05 g 0.05 g NOTA: El CaCO3 se agrega como agente neutralizador. Práctica No.8 Medio líquido para amonificación (Pochon & Tardieux, 1962). Solución salina de Winogradsky Asparagina u otro aminoácido Solución de oligoelementos Agua destilada 50 ml 0.2 g 1 ml 950 ml Solución de Oligoelementos Molibdato de potasio Borato de sodio Citrato de Fierro al 1% Nitrato de Cobalto Sulfato de Cadmio Sulfato de Cobre Sulfato de zinc Sulfato de Manganeso Agua destilada 0.05 g 0.05 g 2.0 ml 0.05 g 0.05 g 0.05 g 0.05 g 0.05 g 1000 ml Hacer pasar una corriente de CO2 en la solución. Reactivo de Nessler Solución A: Yoduro mercúrico 50 g Yoduro de potasio 36.5 g Triturar en un mortero y añadir poco a poco 1000 ml de agua destilada Solución B: Hidróxico de potasio Agua destilada CSP 150 g 1000 ml Momentos antes de ser usada, hacer la mezcla de las soluciones en partes iguales. 64 Práctica No.9 Medio para solubilización de P (Medio Modificado Mínimo de Reyes et al. 1999). NH4Cl KNO3 NaCl MgSO4.7H2O CaCl2.H2O FeSO4.7H2O ZnSO4.7H2O Glucosa Agar 0.4 0g 0.78 g 0.10 g 0.50 g 0.10 g 1.56 mg 1.40 mg 10.0 g 20.0 g El P se adiciona al medio en forma de Ca(PO4)2 a 4 g por litro y el pH se ajusta a 6.5 Práctica No.10 Medio para la oxidación del S (Pochon & Tardieux, 1962). K2HPO4 MgCL2 NaCl NH4NO3 CaCO3 csp H2O 0.25 g 0.10 g 0.10 g 2.00 g 5.00 g 1.000 L El medio se distribuye a razón de 5 ml por tubo utilizando tubos de ensaye de 22 ml. Se tapan los tubos con algodón y se esterilizan en autoclave por 20 minitos a 110ºC. Posteriormente se adiciona por tubo alrededor de 50 mg de flor de azufre, sin agitar. Práctica No.11 Medio de Jain y Patriquin Acido succínico Cloruro de sodio Sulfato de Magnesio Cloruro de calcio Cloruro férrico Molibdato de sodio Cloruro de amonio Agua destilada 2.500 0.100 0.200 0.020 0.010 0.002 1.0 1 000 g g g g g g g ml Las siguientes soluciones se esterilizan por separado y por filtración y se agregan al medio de Jain y Patriquin. Solución de fosfatos pH 7.0 Fosfato dibásico de potasio Fosfato monobásico de potasio 12 % 8% Triptófano 1 mg/ml 65 Fructosa 5% pH final de la solución = 6.8 Nota importante: Al medio base (40 ml por matraz) se le agrega: 2.5 ml de cada uno de los fosfatos 2.5 ml de fructosa 5.0 ml de triptófano Reactivo de Salkowski Cloruro férrico Agua destilada Acido sulfúrico 0.4058 g 33.0 ml 20.0 ml Práctica No.12 Agar-Levadura-Manitol Manitol Extracto de levadura K2HPO4 MgSO4. 7H2O NaCl Rojo Congo (Sol. acuosa 1:400) Agar bacteriológico Agua destilada 10.0 g 0.4 g 0.5 g 0.2 g 0.1 g 10.0 ml 18.0 g 1000 ml pH final Esterilizar por 20 minutos a 110ºC 6.8-7.0 NOTA: Cuando al medio se le adiciona Azul de Bromotimol (5 ml/l en sol. alcohólica al 0.5%), no se le agrega el Rojo Congo. Se adiciona CaCO3 cuando se requiere un agente neutralizador. Práctica No.15 Solución de Fucsina ácida en lactoglicerol Fucsina ácida Lactoglicerol 0.01 g 100 ml Lactoglicerol Acido acético Glicerol Agua 875 ml 63 ml 63 ml 66 Solución mineral de Long-Ashton Sol. de Macroelementos A Sol. de Macroelementos B Sol. de Oligoelementos Sol. de Molibdato de Amonio Sol. Fe-EDTA 2000 ml 1000 ml 100 ml 0.5 ml 40 ml Aforar a 10 litros con agua destilada. Esta solucion se utiliza al 5% v/v para regar las plantas. Sol de Macroelementos A KNO3 K2SO4 Ca(NO3)2.4H2O NaH2PO4.H2O H2O destilada 4.0 g 3.5 g 9.0 g 2.0 g 2000 ml Disolver cada componente, uno por uno, en el agua. Sol. de Macroelementos B MgSO4.7H2O H2O destilada 5.0 g 1000 ml Sol. de oligoelementos MnSO4 CuSO4.5H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 NaCl H2O 2.25 g 0.25 g 0.30 g 3.00 g 5.00 g 1000 ml Sol. de Molibdato de Amonio (NH4)6Mo7O24.4H2O H2O destilada 1.76 g 1000 ml Sol. de Fe-EDTA FeSO4.7H2O Na2EDTA H2O destilada 5.56 g 7.45 g 1000 ml 67 ...
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This note was uploaded on 05/03/2010 for the course MICROBIOLO 15 taught by Professor Luchochartunis during the Spring '06 term at École Normale Supérieure.

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