riboflavin - Chem 131A: Absorbance of Riboflavin

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Chem 131A: Absorbance of Riboflavin Purpose:  The purpose of this experiment is to: 1) Familiarize the student with the use of the HP 8452 diode  array spectrophotometer, 2) examine the limitations of the photometer, 3) familiarize the student with the  Beer-Lambert law and its use, and 4) learn how to properly prepare a dilution series. Absorbance Measurements and Adherence to the Beer-Lambert Law The Beer-Lambert law is only valid for low solute concentrations.  Violation of the law can be  attributed to solute-solute interactions and/or the amount of light that can be accurately measured by the  spectrophotometer itself.  Typically, the latter defines the limit.  The low light levels reaching the  photomultiplier at high solute concentrations cannot be precisely measured which usually results in an  underestimation of the absorbance.  It is important, therefore, that you determine the "absorbance limit"  (highest absorbance that follows the Beer-Lambert law) for any spectrophotometer that you plan to use for  analytical purposes. Measurement of this limit is readily determined by measuring a series of solutions in which the solute  concentration is varied.  A plot of absorbance versus concentration of the solute will reveal a linear portion at  the lower solute concentrations and a downward curvature at high solute concentrations where the law is  violated.  Placing a ruler along the data will readily show where the plot becomes non-linear and hence show  the absorbance limit for the spectrophotometer. The particular absorbance limit is a function of the spectrophotometer design, wavelength of the light,  and the age of the excitation lamp.  The manufacturer provides an estimation of such limits, but bases this  estimation on the performance of the spectrophotometer when it was new.  As the spectrophotometer ages, the  performance of the optics and electronics can fall below the manufacturer’s specifications resulting in a lower  absorbance limit.  The wavelength dependence is due to the fact that the intensity of light put out by the  excitation lamp is not the same for all wavelengths.  Typically, the intensity is lower at high and low  wavelengths than within the midrange of wavelengths.  You may readily observe this phenomenon with the  HP8452A spectrophotometer when you employ the lamp test function.  In light of this, you need to evaluate  the absorbance limit at or near the wavelength that you plan to use in your measurements.  As a lamp ages, the  intensity at all wavelengths decreases.   This necessarily results in a reduced absorbance limit.  Periodic 
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This note was uploaded on 09/08/2010 for the course CHEM 132L at San Jose State.

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