Tema 6: “Técnicas de fraccionamiento
y aislamiento”
6.1 Introducción general.
La Bioquímica comprende el estudio de las biomoléculas que componen los seres vivos.
Dichas moléculas formarán parte de las células que, a su vez, constituirán nuestros
tejidos y órganos. Para poder estudiar dichas biomoléculas, primero tendremos que
extraerlas y aislarlas de su entorno, ya sea una célula o un fluido biológico. El primer
paso será la homogeneización del tejido de partida; una vez obtenido el extracto celular
o fluido biológico, le aplicaremos diferentes técnicas de separación y análisis.
6.2 Homogeneización.
Se trata del proceso mediante el cual se llevará a cabo la ruptura de tejidos y células para
obtener un homogeneizado, extracto celular o extracto crudo donde se encontrarán las
sustancias de interés. El objetivo será obtener biomoléculas solubles o, en algunos casos,
orgánulos celulares.
Métodos de homogeneización:
Distinguiremos dos tipos, los mecánicos y los no mecánicos. A la hora de elegir el
método a utilizar, hemos de tener en cuenta cuál es el material biológico de partida, así
como la naturaleza y cantidad necesaria de la biomolécula que buscamos purificar o
analizar (su sensibilidad a la degradación enzimática, oxidación…). También debemos
tener clara la finalidad del experimento: si es necesario o no preservar la estructura y/o
función de dichos orgánulos o biomoléculas. Por otra parte, será de gran importancia
controlar la temperatura en que se realice esta técnica puesto que, dado que la mayoría
de las biomoléculas serán termolábiles, podrán desnaturalizarse al subir la temperatura.
·
Métodos mecánicos
: inespecíficos (en los que la rotura de las células se dará por
acción de una fuerza mecánica) y agresivos. Requieren mucha energía y algunos generan
elevadas temperaturas que podrán desnaturalizar ciertas biomoléculas. A continuación,
estudiaremos sus tipos:
a)
Homogeneización
: método suave de fricción, donde el equipo utilizado se
denominará
homogeneizador
. Existirán tres tipos de homogeneizadores:
a.
Homogeneizadores de émbolo y tubo
: formados por un tubo de
vidrio y un émbolo entre los que existirá una separación de distinto
tamaño (normalmente, mm). Al introducir el tejido a homogeneizar
en el tubo, obligaremos al tejido a entrar en dicho espacio,
fraccionando la muestra. Solo se utilizará este equipo para
homogeneizar tejidos animales
blandos
(cerebro, hígado…),
frecuentemente para obtener orgánulos celulares. Tendrá un buen
control de temperatura, puesto que se realizará en hielo, reduciendo
así el efecto del calor que se produzca durante la fricción del
instrumento. Estos instrumentos podrán ser manuales o
automáticos.
b.
Trituradores
: también denominados
blender
(batidora), serán
equipos de homogeneización por cuchillas. Tendrán una rotación de
6.000-50.000 rpm, dando lugar a una gran homogeneización de la
muestra, que presentará fragmentos finos (4 µm). Se utilizará con
tejidos vegetales y animales, no con microorganismos.
