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8. Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas Nieves Abril Díaz 1 , J. Antonio Bárcena Ruiz 1 , Emilio Fernández Reyes 1 , Aurora Galván Cejudo 1 , Jesús Jorrín Novo 1 , José Peinado Peinado 1 , Fermín Toribio Meléndez-Valdés 1 , Isaac Túnez Fiñana 2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, 1 Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba, 2 Facultad de Medicina, Avda. Menéndez Pidal s/n, 14004-Córdoba. RESUMEN La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. En esta práctica se darán a conocer las características generales y conceptos relacionados con la espectrofotometría. A continuación y tras la explicación del funcionamiento del espectrofotómetro se harán espectros de absorción con el fin de determinar la longitud de onda donde la muestra presenta la máxima absorción, y tras realizar las correspondientes rectas de calibrado se cuantificarán las concentraciones de distintas biomoléculas. Palabras clave : Absorbancia; transmitancia; colorimetría; cromóforo; espectro; rectas de calibrado. Abreviaturas empleadas . A: Absorbancia; 4-AP: 4-Aminoantipirina; FMN: flavin mononucleótido; FMNH 2 : forma reducida del flavin mononucleótido; I: intensidad de luz; N-NEDA: N-Naftol-1-etilendiamino; p-NP: p -nitrofenol; POD: Peroxidasa; T: transmitancia; UV: luz ultravioleta. 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula requiere la utilización de técnicas analíticas que permitan su determinación cualitativa y cuantitativa, así como su caracterización físico-química y biológica. Uno de los métodos más sencillos, accesibles, útiles y utilizados es la espectroscopía, en general, y la espectroscopía ultravioleta-visible, en particular. Se pueden identificar y cuantificar biomoléculas en solución y en muestras biológicas, con el empleo 1
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de reactivos específicos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto coloreado que permite detectarlo en muestras complejas. El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV- visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo que dicha técnica constituye un valioso instrumento para la determinación y caracterización de biomoléculas.
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