PCR实验技术指南

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Unformatted text preview: PCR 的问题,无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题。今天我们把相关内容整理出来, 与大家共同讨论,希望对大家能有所帮助。 一、引物设计 所谓 “ 工欲善其事,必先利其器 ” ,这年头手工设计引物的人似乎不多,还是用软件方便些, 防止你一不小心看走眼,丢一个碱基,同时计算起来也方便。设计软件有很多,既可以在线 设计(如 Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi ),也可以用 Primer5 、 Oligo6.65 等等。 1. 引物设计的原则 细心地进行引物设计是 PCR 中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列 而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同时扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了 一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点: 1 )典型的引物 18 到 24 个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于 非目的序列位点的可能性。但是长度大于 24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的 序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。 2 )选择 GC 含量为 40 %到 60 %或 GC 含量与模板 GC 含量接近的引物。 3 )设计 5' 端和中间区为 G 或 C 的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的 稳定性。 4 )避免引物对 3' 末端存在互补序列,这会形成引物二聚体,抑制扩增。在用软件设计时大 家常常会疑惑 , 究竟 ? G 不能低于多少 ? 这里有个数据 : ? G 为 0~-2 时 ,PCR 产率可达 100%, ? G=-6 时 , 为 40%. 5 )避免 3' 末端富含 GC 。设计引物时保证在最后 5 个核苷中含有 3 个 A 或 T 。 6 )避免 3' 末端的错误配对。 3' 端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 3’ 最好以 G 或 C 结尾,防止 AT 的松散结合引起错配。 7 )避免存在可能会产生内部二级结构如发夹结构的序列,这会破坏引物退火稳定性。 8 )引物的一个重要参数是熔解温度( Tm )。这是当 50 %的引物和互补序列表现为双链 DNA 分子时的温度。两引物的 Tm 值相差不应大于 5 ℃。计算 Tm 有几种公式。第一个公式 (Wallace 规则 ):Tm = 4 ℃( g + C ) +2 ℃( a + T ) , 这来源于高盐溶液中的杂交,适用于小于 15-20 个碱基的引物 , 也适用于手工设计时的简单计算。第二个公式 (Baldino 算法 ) 适用于计 算 14-70 个核苷酸在 ≤0.4mol\L 的阳离子溶液中的 Tm, 也可用于扩增产物的 Tm 计 算 .Tm=81.5+16.6*lg[K + ]+0.41(%[G+C])-(675/n) 。以上两种算法都是基于碱基组成而不是碱基 排列而计算的,事实上相同碱基组成的引物 Tm 可能差异不小: GGGAA 和 GAGAG 的 Tm 是不一样的,所以确定引物 Tm 最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和...
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This note was uploaded on 03/24/2012 for the course ION 102 taught by Professor Zhoueu during the Spring '12 term at Peking Uni..

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