BiotechTTA 3 2

BiotechTTA 3 2 - Pécs Miklós: A biotechnológia...

Info iconThis preview shows page 1. Sign up to view the full content.

View Full Document Right Arrow Icon
This is the end of the preview. Sign up to access the rest of the document.

Unformatted text preview: Pécs Miklós: A biotechnológia természettudományi alapjai . 3.2 Protoplasztfúzió III/2. Protoplaszt fúzió Protoplasztok Protoplaszt: Sejtfalától megfosztott, kívülről csak sejtmembránnal borított sejt. Mesterségesen hozzuk létre a sejtfal eltávolításával. Elveszti az alakját, gömbölyű citoplazma cseppé válik. Nagyon sérülékeny, érzékeny a: – mechanikai hatásokra (keverés, rázás, pipettázás) – ozmózis nyomásra (csak tömény cukoroldatokban tartható) Sejtfal Mindenféle sejtből (baktérium, élesztő, növény) lehet protoplasztot csinálni, de a tipikus alkalmazása a növények genetikai manipulációja. Citoplazma Sejtmag DNS Kloroplasztisz DNS Mitokondrium DNS 1 Protoplaszt izolálás, előállítás Protoplaszt 2 Protoplaszt izolálás, előállítás Protoplaszt Sejtfal lebontása: Sejtfal 1. Megfelelő sejt kiválasztása Elvileg bármely sejtből előállítható, de a legegyszerűbb laboratóriumban nevelt növényi szövettenyészetből. 2. Steril körülmények biztosítása: Steril edények, táptalaj (a mikrobák ellen antibiotikum) Manipuláció steril levegőjű térben 3. A sejtfal leemésztése megfelelő enzimekkel. 4. Kíméletes körülmények: 4. a protoplasztok mechanikailag sérülékenyek, a pipettázás, centrifugálás, keverés, rázás során vigyázni 5.Ozmotikus védelem: Plazmolitikumok - nem metabolizálható szénhidrátok (mannit, xilit, szorbit) használata (10-13%). A glükóz vagy szacharóz metabolizálódik, ezért csökken a közeg ozmózisnyomása. Ezért csak sejtfal-regenerálásnál alkalmazzák. 3 Protoplaszt előállítás 4 Protoplasztok tenyésztése Centrifugálás: BABCOCK-CSŐBEN, „felfugálás” A protoplasztok sűrűsége kisebb, mint a vízé, ezért feljönnek felszínre. 5 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék A protoplasztot a sejtfal hiánya nem akadályozza a növekedésben és az osztódásban. Szénhidrátok: – bontható cukrok – tápanyag (glükóz, szacharóz, maltóz v. ezek keveréke) – nem bontható cukoralkoholok - plazmolitikumok Tápoldat: ásványi sók Növényi hormonok Módszer: mikroszkóp alatt, tárgylemezen, néhány cseppnyi folyadékban 6 1 Pécs Miklós: A biotechnológia természettudományi alapjai . Protoplaszt fúzió 3.2 Protoplasztfúzió Protoplaszt fúziós módszerek Protoplaszt fúzió: két protoplaszt beltartalamának egyesítése, fúziója. Eukarióták esetében a hibridnek két különböző sejtmagja lesz (heterokarion), és tartalmazza mindkét fél kloroplasztjait és mitokondriumait is (amelyek szintén tartalmaznak DNSt). A fúzió után a hibrid sejt a következő osztódások során a fölös számú kromoszómák nagy részét elveszti, és valamelyik szülő félhez válik hasonlóvá, csak néhány új gén/tulajdonság stabilizálódik. Ez a génmanipulációs módszer sem célzott, irányított, a létrejövő utódok tulajdonságai véletlenszerűen alakulnak ki. → szelekció Mikroszkóp alatt, speciális tárgylemezen, folyadékban (elektromos és/vagy vegyszeres technikák) Burgonya PP elektrofúziója: 7 Növények regenerálása protoplasztból Az növényi sejtek különleges tulajdonsága a totipotencia = egyetlen sejtből regenerálható a teljes növény, ami azután kiültethető, szaporítható. Egy megváltoztatott tulajdonságú sejtből teljes, életképes növényt fejleszthetünk, amelynek minden sejtje hordozza az új géneket. Az ivarsejtek is, azaz a változás öröklődik. 9 Protoplasztból növényregenerálás Az első protoplasztból regenerált növény a dohány volt (Takabe 1971). Lépések: 8 Protoplaszt tenyésztés, regenerálás A regenerálás első lépése a sejtfal újraképzése. A falszintézis a protoplaszt létrejöttének pillanatától megindul. Ezt a természetes folyamatot meg lehet gyorsítani, egyrészt hormonálisan, másrészt a közeg ozmózisnyomásának fokozatos csökkentésével. Pl.: a kiindulásnál 9 %-nyi mannitot a hetenkénti átoltásnál 6, majd 3 %-ra csökkentik. A regenerálódó sejtek előbb sejtcsomókat képeznek (szuszpenziós tenyészet), majd kalluszt (nem differenciálódott növényi sejtek együttese) képeznek. Ebből aztán teljes növényt lehet regenerálni. 10 Fertilis búzanövények felnevelése protoplasztokból A: PP eredetű többsejtes kolónia B: Mikrokolóniák kialakulása agarózba ágyazott sejtekből C: kallusz tenyészet D: PP eredetű fertilis búzanövény 11 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 12 2 Pécs Miklós: A biotechnológia természettudományi alapjai . 3.2 Protoplasztfúzió Keresztezés és protoplaszt fúzió Keresztezés és protoplaszt fúzió Keresztezés: két különböző tulajdonságú egyed génállományának egyesítése ivaros szaporítással. Régi nemesítési módszer – kulcsszerepe (volt) az új fajták előállításában Fajon belüli fajták keresztezése: néhány tulajdonság változik De: nem lehet mindent keresztezni mindennel. Csak rokon fajták, fajok között működik. A rendszertani távolság növeli az inkompatibilitást. A megtermékenyítés szabályozása (anatómiai és egyéb) rendszerint kizárja az idegen pollennel való beporzást, csak a fajon belül termékenyül. → ezért előnyös keresztezés helyett protoplasztokat egyesíteni, ez megkerüli az ivaros szaporodás akadályait. A fúzió nagyon különböző fajok között is lehetséges! „Mindent mindennel lehet fúzionáltatni” – a protoplasztok szintjén – de azután jönnek a problémák. A fúzionált sejtek osztódnak, de a növény-regeneráció csak ritkán valósítható meg. Sejtvonalként fenntarthatók, de nem regenerálhatók: sárgarépa-árpa, szója-repce, kukorica-borsó, szója-Drosophila: mindkét sejtmag osztódik petúnia-egér: osztódás, sejtfal és hemoglobin szintézis 13 14 Protoplaszt fúzió, aszimmetrikus hibridek Cibridizáció Ha sikerül is növényt nevelni, akkor legtöbbször rendellenes morfológiájú és steril alakok jönnek létre. = citoplazmatikus hibridizáció Hosszú (több éves) sejttenyésztés során valamelyik partner génjei fokozatosan eltűnnek, és csak néhány kromoszóma marad = aszimmetrikus hibrid Ezekből lehet élet- és szaporodóképes növényt regenerálni, ami a domináns eredeti partnerhez képest csak egy-két új tulajdonságot hordoz. Nem a sejtmagban lévő kromoszómák átvitelére irányul, hanem a sejtszervekben (kloroplaszt, mitokondrium) lévő DNS bevitelére. A hibrid sejtben az egyik félből származik a sejtmag, a másikból kloroplasztok új kombinációk új tulajdonságok 15 Protoplaszt fúzió - eredmények 16 Protoplaszt fúzió - értékelés Vírus-rezisztens burgonya fajták előállítása: Solanum tuberosum (étkezési burgonya) és Solanum brevidens (perui, vírusálló fajta) fúziója → A vírus-rezisztencia átment a kultúrfajba. 17 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék Ez sem célzott, irányított változtatás. Nem lehet előre tudni, hogy milyen tulajdonságok stabilizálódnak végül Lassú módszer, hónapokig, évekig tart. A kiszámíthatatlansága miatt hátrányos tulajdonságok is átkerülhetnek ~40 éve művelik, klasszikus technika. Veszélyessége kicsi, mert: – A hibridek általában kevésbé életképesek, mint a vad törzsek – a természetbe kikerülve nem versenyképesek – A természetben jelen lévő gének a saját környezetükkel együtt kerülnek át más sejtbe. 18 3 ...
View Full Document

Ask a homework question - tutors are online