BiotechTTA 3 3 SZ

BiotechTTA 3 3 SZ - Pécs Miklós: A biotechnológia...

Info iconThis preview shows page 1. Sign up to view the full content.

View Full Document Right Arrow Icon
This is the end of the preview. Sign up to access the rest of the document.

Unformatted text preview: Pécs Miklós: A biotechnológia természettudományi alapjai 3.3 Génátvitel vektorokkal III/3. Gének átvitele vektorokkal Vektorok Vektor: (molekuláris) biológiai rendszer, amely képes új/idegen genetikai információt bejuttatni egy sejtbe. Független szaporodásra képes. Más csoportosítás szerint: Klónozó vektorok: csak a gén(ek) bevitelére alkalmas, a kiíráshoz nem tartalmaz semmit. Expressziós vektorok: a bevinni kívánt gén(ek) mellett a szabályozott kiíráshoz szükséges szakaszokat is tartalmazza → Expressziós kazetta/keret: a célgén előtt: promóter szakasz, utána: terminátor szakasz. Fajtái: – – – – Plazmidok (1-10 kb) Bakteriofágok (10 – 23 kb) Más vírusok Mesterséges kromoszómák (~300 kb) 1 2 Plazmid vektorok Plazmid vektorok A plazmid vektorok jellemző részei: plazmid • Replikációs origó – a plazmid DNS duplikációjának kezdőpontja, enélkül nem tud sokszorozódni a plazmid • Promóter szakasz - itt indul a kiírás mRNS-re (ld. operon) • Célgén(ek) – ezek által kódolt fehérjét akarjuk előállítani a sejttel • Terminátor szakasz – ez zárja le a kiírandó gének sorát. • Marker gén(ek) – a sikeresen bevitt és működő géneket tartalmazó sejtek szelekcióját segítik, pl. antibiotikum rezisztencia → antibiotikumot tartalmazó tápoldaton csak a plazmidos sejtek növekednek, a többi elpusztul. A plazmid vektorok jellemző részei: ori = replikációs origó ampR = ampicillin rezisztencia gén MCS = multiple cutting site = (többféleképpen) felvágható szakasz = itt lehet felnyitni a gyűrűt, és beilleszteni amit akarunk. 3 4 Restrikciós enzimek „Ragadós” végek 1. Az átvinni kívánt gén izolálása: a hordozó sejt DNSének feldarabolása, a keresett gén izolálása 2. Beépítés a plazmid DNS-be. „Szabás-varrás” Kell hozzá olló és ragasztó. „Olló:” enzimek, restrikciós endonukleázok. A kettős szálú DNS-t hasítják, de csak bizonyos helyeken. Tükörképi DNS szakaszoknál „ragadós véget” hoz létre. Mikroorganizmus Enzim szekvencia 5’ 3’ λ Bontási helyek száma Aα 2 SV40 фx174 Arthobacter lutens AluI AG CT >50 >50 35 Brevibact. albidum BalI TGG CAA 15 17 0 0 HaeIII GG C’C >50 >50 19 11 H. aegypticus 24 GTT AAC 13 6 4 3 SmaI CCC GGG 3 12 0 0 B. amyloliquefaciens H BamHI G GATC’C 5 3 1 0 EcoRI G AA’TTC 5 5 1 0 H. influenzae Rd HindIII A’ AGCTT 6 11 6 0 H. parainfluenzae HpaII C C’GG >50 >50 1 5 K. pneumoniae OK8 KpnI GGTAC C 2 8 1 0 X. holcicola BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék HpaI Serr. marcescens Sb E. coli RY13 5 H. parainfluenzae XhoI C TCGAG 1 6 0 1 6 1 Pécs Miklós: A biotechnológia természettudományi alapjai 3.3 Génátvitel vektorokkal Átvitel plazmidokkal Átvitel plazmidokkal „Ragasztó”: a ragadós végek maguktól is összetapadnak, de a cukor-foszfát lánc összekapcsolásához kell a T4 DNSligáz enzim. 3. Bevitel a gazdasejtbe: - kémiai, - elektromos hatásokkal 4. Manifesztáció + szelekció: a kívánt gén mellé egy marker (nyomjelző) gént is beépítenek (pl. antibiotikum-rezisztencia), ami segít kiválasztani azokat a sejteket, ahol megtörtént a beépülés, és „működik” a plazmid. Az adott antibiotikumot tartalmazó táptalajon csak a rezisztenciagént (azaz a plazmidot) sejtek indulnak növekedésnek. 7 8 Teljes séma: Rekombináns fehérjék előállítása Ezzel az eljárással a prokariótákba és eukariótákba szinte bármilyen gént be lehet vinni. A humán inzulin (proinzulin) előállítása E. coliban. Genentech, 1978. Humulin Cél: fehérjetermelés – hormonok – vakcinák – enzimek – immunfehérjék – vérfehérjék 9 Ingázó (shuttle) vektorok 10 Ingázó (shuttle) vektorok Az eukarióták plazmidjai és vírusai másképpen szaporodnak mint a prokariótáké, másfajta replikációs origójuk van. Az eukarióta sejtek génmanipulációjához tehát más vektorokra van szükség. Sokszor viszont baktériumokból kell átvinni géneket eukariótákba – és vissza. Ehhez olyan vektorokra van szükség, amelyek mindkét sejttípusban szaporodni tudnak. Ezekben kétféle replikációs origó található, egy a prokarióta és egy az eukarióta sejtekhez. Emellett a rezisztencia markerek is különbözők, másfajta antibiotikumok hatékonyak a prokarióták és eukarióták ellen kétféle rezisztencia gént kell beépíteni. 11 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 12 2 Pécs Miklós: A biotechnológia természettudományi alapjai 3.3 Génátvitel vektorokkal Génátvitel Agrobacterium plazmidokkal 2. Agrobacterium rhizogenes: RI (root inducing) plazmidja vattaszerű hajszálgyökér burjánzást okoz. Az Agrobacteriumok 4 faja isAz mert: 3. Agrobacterium rubi: gyümölcsfánál, málnánál gyökérgolyva, vesszőgolyva 1. Agrobacterium tumefaciens: gyökérgolyva, koronagubacs. A sérülések helyén alakul ki fertőzés. 4. Agrobacterium radiobacter: plazmidja nem okoz betegséget, de antibiotikumot (agrocint) termelő gént hordoz. Ugyanezen a plazmidon található az agrocin elleni rezisztenciát biztosító gén is – megvédi saját magát. A Ti plazmid nem differenciált szövetburjánzást idéz elő. A sejtek olyan anyagokat termelnek amelyeket a baktérium felhasznál. 13 14 Az A. tumefaciens fertőzés Az A. tumefaciens fertőzés Az Agrobacterium tumefaciens egy Gram-negatív növénypatogén talajbaktérium, amely a kétszikű növényeket a sebzési helyeken megfertőzi és tumorokat okoz rajtuk. A baktériumok patogenitása összefügg a tumorindukáló (Ti) plazmid jelenlétével. A Ti plazmid egy része (transzfer DNS = T-DNS) a kórfolyamat során átkerül a növényi sejtbe és a sejtmag DNS-állományába integrálódik (A T-DNS régióban helyezkednek el a tumorok kialakulásáért felelős gének.) Kétszikűeknél: Az Agrobacterium tumefaciens növénypatogén törzs Ti (tumor indukáló) plazmidja a T-DNS szakaszt beépíti a megfertőzött növény kromoszómájába. 15 16 A Ti plazmid Génátvitel a Ti plazmiddal 1,2 x 108 molekulatömegű, gyűrű alakú DNS molekula. A baktériumban önállóan replikálódó genetikai egység. A plazmid DNS-nek van egy transzformáló (T-) DNS szakasza. Ennek nagysága 20 000 bázispár, ez jut be a gazdasejtbe a fertőzést követően, majd stabilan beépül a növényi kromoszómába. A sejtburjánzás mellett olyan aminosav származékokat termeltet a növénnyel, amelyeket az Agrobacterium tápanyagként hasznosít, emellett olyan növényi hormonanalógok képződnek, amelyek a gyökér- és szárnövekedést leállítják, ezzel is előnyt adva a tumorsejtek növekedésének. A Ti plazmidok alkalmasak arra, hogy vektorként szolgáljanak „idegen” DNS szakaszoknak a gazda növények kromoszómáiba történő beviteléhez. 17 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék Ha a T-DNS szakaszba a tumorindukáló gének helyére más géneket építenek be, azok éppúgy integrálódnak a növényi genomba. E rendszer felhasználásával a növények gyakorlatilag bármely génnel transzformálhatók. A genomba juttatandó T-DNS szakaszokba általában rezisztencia géneket is elhelyeznek, ami lehetővé teszi a transzformáns növények egyszerű szelektálását. Növényeknél értelemszerűen az antibiotikum rezisztencia helyett herbicid rezisztencia géneket alkalmaznak. 18 3 Pécs Miklós: A biotechnológia természettudományi alapjai 3.3 Génátvitel vektorokkal A T-DNS felépítése Növényregenerálás Határoló régiók: ezek a T-DNS „jobb és bal oldali” végei, amelyek a kromoszómába való integrálódáshoz nélkülözhetetlenek. – Ezen belül: expressziós kazetta, az elején promóter, a végén terminátor régióval, melyek a gén működését, expresszióját (kifejeződését) teszik lehetővé. • Ezen belül: – szelekciós marker gén (antibiotikum- vagy herbicid-rezisztencia gén), és a – hasznos gén (egy hasznos növényi tulajdonság génje, amit be akarunk vinni a növénybe) A Ti plazmidokkal be lehet vinni géneket a növényi sejtekbe, de ezek a gének nem jelennek meg az egész növényben, csak a tumorsejtekben, és nem öröklődnek. Ahhoz, hogy minden sejtben megjelenő, öröklődő tulajdonságot kapjunk, ki kell emelni egy tumorsejtet, és abból regenerálni a teljes növényt. 19 (A protoplaszt-fúziónál már említettük, hogy ez kivitelezhető) 20 Növényregenerálás A növényeknél egy növényeknél sejtből vissza lehet nevelni az egész növényt, a tumorsejtből kiindulva is regenerálható szaporodóképes növény. 21 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 4 ...
View Full Document

This note was uploaded on 04/09/2012 for the course BIO 01 taught by Professor Miklospecs during the Spring '11 term at BME.

Ask a homework question - tutors are online