El segundo gel o gel de resolucin es el que realmente

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Unformatted text preview: Las movilidades de las proteínas en los geles de Las SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo de su peso molecular. de Inicio de la PAGE discontinua Inicio Al inicio de la electroforesis, las muestras se colocan en un pozo. El volumen puede ser variable en cada muestra aunque la cantidad de proteína debe ser constante. Reserva de amortiguador Tris-glicina, pH 8.3 Muestra Tris-HCl, pH 6.8 Gel de compactación Tris-HCl, pH 6.8 Gel de resolución Tris-HCl, pH 8.8 Reserva de amortiguador Tris-glicina, pH 8.3 + Compactación (“stacking”) Compactación El primer gel o gel de compactación (“stacking”) es de mayor poro (menor porcentaje de acrilamida+bisacrilamid a) y tiene un pH más ácido que el segundo gel. Las proteínas se focalizan (compactan) formando una banda delgada Separación en el gel resolutivo. El segundo gel, o gel de resolución, es el que realmente separa a las proteínas. Presenta un poro menor y un pH de 8.8. Proteínas fraccionadas en el gel de separación Frontera Glicina/cloruro Relación entre la movilidad electroforética y la masa molecular (PAGE-SDS) molecular Logaritmo de la Masa molecular kDa 200 100 50 40 30 20 0 0 2 4 0 0.16 0.33 6 8 10 12 0.5 0.66 0.8 1 Movilidad electroforética (cm) Movilidad relativa Geles en gradiente Geles • El uso de geles de poliacrilamida que tienen un El gradiente creciente de concentración de acrilamida+bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamaño de poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida. Características de los geles en gradiente. gradiente. • Generalmente los gradientes se establecen entre el 3 y el Generalmente 30% de acrilamida en gradientes lineales o cóncavos. • El rango a emplear dependerá del tamaño de las proteínas El a separar. • En un gel en gradiente la proteína migra hasta que alcanza En una zona donde el tamaño de poro impide cualquier avance. • Una vez se alcanza el “límite de poro” no se produce una Una migración apreciable aunque no se detiene completamente. Ventajas • Resuelve mejor las bandas pues las Resuelve concentra en regiones muy estrechas. • Incrementa el rango de pesos moleculares Incrementa que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una concentración fija. fija. Preparaci...
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This document was uploaded on 12/14/2013.

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