Exam Notes - BIOCHEMISTRYLABEXAMREVIEW...

BIOCHEMISTRY LAB EXAM REVIEW
LAB 1: ENZYMATIC CHARACTERIZATION OF HEART
TRANSAMINASES BACKGROUND
-
Transaminases catalyze the transfer of an amino group from one amino acid to a
keto acid.
-
The reaction occurs without yielding free NH3; the amino group is retained through
the transfer to the vitamin B6 derivative pyridoxal phosphate (PLP), a prosthetic
group present within the transaminase.
-
The reaction involves the formation of a Schiff base intermediate between the amino
acid and the PLP (Garrett, R.H. and Grisham, C.M., 2004).
-
Glutamate-Oxaloacetate Transaminase (GOT) and Glutamate-Pyruvate
Transaminase (GPT) are responsible for the transfer of an amino group from
glutamate to oxaloacetate and pyruvate respectively.
-
The transamination reaction is reversible ( Δ Go 0) and can be initiated from either ≈
direction by supplying the appropriate substrates.
-
The equilibrium constant of this reversible reaction can be determined by measuring
the concentration of each component at equilibrium.
-
Transaminases play an important role in amino acid metabolism:
1)
deamination: most amino acids transfer their amino group to  -ketoglutarate to α
form glutamate.
2)
The glutamate is converted by the action of GOT into aspartate, a precursor of
the urea cycle. 3) The second amino group in the urea comes from the
deamination of glutamate through the glutamate dehydrogenase reaction.
-
urea excretion is the pathway used for elimination of nitrogen by most terrestrial
vertebrates.
-
In the muscle, GPT is responsible for the conversion of pyruvate into alanine which
is delivered to the liver where it is used for glucose synthesis. The amino group of
alanine ends up in the urea cycle (Ratner, S. 1977;  Voet, D. and Voet, J.G., 2004).
-
Other transaminases are involved in the transfer of the amino group from glutamate
to different keto acid precursors of some amino acids synthesis.

-
Transaminases are intracellular enzymes, and are present in high concentrations in
muscle and liver.    - Under conditions of extensive tissue damage, necrosis and cell
breakdown such as hepatitis and myocardial infarction, these enzymes leak
into the blood stream. Thus, high serum levels of GPT and GOT are
indicators of those diseases.
COUPLED ASSAY OF TRANSAMINASES
-
Assays of transaminase activity are usually performed in the direction which
generates pyruvate (GPT) or oxaloacetate (GOT)because it is easy to measure
pyruvate using the coupled oxidation of NADH to NAD.  - In an incubation buffer with
an excess of NADH and lactate dehydrogenase LDH, (malate dehydrogenase,
MDH, in the case of GOT assay) the pyruvate, produced by the GPT
transferral of NH2 from alanine to  - α ketoglutarate, is reduced to form lactate. This
reduction can be measured by the decrease in 340 nm absorbance of NADH
upon oxidation to NAD.
-
At high levels of NADH and LDH, the conversion of pyruvate into lactate is not rate