Hay que considerar el uso de un marcador est\u00e1ndar de prote\u00ednas para la medici\u00f3n

Hay que considerar el uso de un marcador estándar de

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cillo contiguo. Hay que considerar el uso de un marcador estándar de proteínas para la medición del peso molecular de la muestra, que debe someterse a los mismos tratamien- tos que la proteína. Una vez colocadas las muestras de proteínas en cada pocillo del gel, se conectan los cables correspondientes de los electrodos a la fuente de energía, con la selección de voltaje o amperaje adecuados. Para el cálculo del voltaje es importante conocer la distancia en centímetros del gel desde la parte superior hasta la parte inferior. La distancia multiplicada por 8-15 V permitirá determinar el voltaje del corrimiento. El voltaje óptimo dependerá de la molécula que se piensa separar; en consecuencia, se recomienda es- tandarizar este procedimiento. El valor del amperaje o co- rriente eléctrica (medida en amperios o miliamperios) de- penderá de la fuerza iónica del buffer . En el caso de trabajar con buffer Tris-SDS-glicina, el valor recomendado es de 25 a 30 mA. La electroforesis se realiza hasta que el colorante, visualizado como una línea azul, haya llegado a los límites de la parte inferior del gel. Visualización de las muestras Si se requiere, el gel se sumerge en un recipiente que con- tiene el colorante azul brillante de Coomassie y se incuba por unos minutos; esto permitirá la visualización de las bandas de proteínas. El proceso de coloración se basa en la atracción electrostática del enlace peptídico de las proteí- nas sobre grupos de ácido sulfónico, que tiñen la proteína de color azul. Asimismo, las fuerzas de van der Waals y las interacciones hidrofóbicas participan en este proceso de unión mecánica. La tinción de Coomassie Blue clási- ca, por lo general puede detectar bandas de proteína de 50 ng mientras que la tinción con plata incrementa este límite de sensibilidad unas 50 veces. La tinción con plata consiste en desarrollar el color en el gel por incubación en soluciones de metano al 140%: ácido acético al 10%, luego metanol al 40%, seguido de agua y posteriormente tiosul- fato de sodio al 0.01%. Después de este proceso, se lava y se procede a la incubación en frío (4°C) en cloruro de plata al 0.1%; posteriormente, se lava e incuba con carbonato de sodio al 2% en formalina al 0.04% (llamada también formol al 35%), que actúa como revelador. Por último, se incuba con soluciones de ácido acético antes de fotografiar o es- canear. Muchas variables pueden influir en la intensidad del color y todas las proteínas tienen características distintas de tinción. Algunas veces, el gel se seca para conservarlo. Para ello, primero se deshidrata en glicerol-metanol y, poste- riormente, se coloca en una lámina de celofán hidrofíli- co y no plastificado que cubra totalmente el gel. Se cubre el gel con un segundo celofán previamente remojado en agua y se sella con calor. Aquí se deja secar en condiciones ambientales por aproximadamente dos días o se acelera el proceso con el uso de desecadores de geles.
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