abordagem denominada de RT PCR Reverse Transcription and Polimerase Chain

Abordagem denominada de rt pcr reverse transcription

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abordagem denominada de RT-PCR (Reverse Transcription and Polimerase Chain Reaction ) é muito útil para se analisar de maneira rápida a expressão de genes de interesse, pois uma vez que a PCR é realizada a partir de cDNA, o fragmento correspondente ao gene de interesse só será amplificado naquelas células ou tecidos onde o gene é expresso. Esta técnica pode ser utilizada para clonagem de um cDNA de interesse, desde que já se tenha alguma informação de sua seqüência, sem a necessidade de se construir uma biblioteca de cDNA para isolá - lo.
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57 VI. SEQÜENCIAMENTO D E DNA A partir do final da década de 70 tornou-se possível a determinar a seqüência nucleotídica de fragmentos de DNA. O desenvolvimento da metodologia descrita por Sanger e cols associado a avanços tecnológicos, permite que hoje genomas inteiros sejam seqüenciados. O princípio do método de terminação da cadeia para seqüenciamento de DNA baseia -se na síntese de DNA in vitro realizada na presença didesoxirribonucleotídeos. Um DNA purificado pode ser sintetizado in vitro em uma mistura que contém moléculas de fita única de DNA, enzima DNA polimerase, um DNA iniciador que possibilita a polimerase iniciar a síntese de DNA utilizando os desoxirribonucleotídios. Alternativamente, na presença de didesoxirribonucleotídeos (ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP) na reação, o elongamento da cadeia de DNA é bloqueado pela incorporação do nucleotídeo sem um grupo OH na posição 3'. No método originalmente desenvolvido por Sanger para seqüenciamento de DNA, uma fita complementar é sintetizada utilizando um mistura de desoxirribonucleotídeos, um deles marcado com P 32 ou S 35 . São realizadas 4 reações independentes, contendo uma pequena quantidade de um tipo de didesoxirribonucleotídio em cada uma das reações. Cada reação produz um conjunto de cópias do DNA inicial que terminam em diferentes pontos da sua seqüência. Os produtos destas quatro reações são separados por eletroforese, utilizando quatro raias paralelas em um gel de poliacrilamida e os fragmentos são detectados através da marcação radioativa. Em cada um das raias, as bandas representam fragmentos que foram terminados em dado nucleotídeo em diferentes posições do fragmento inicial de DNA. Pela análise da ordem das bandas, começando pelo final do gel através das quatro raias, pode - se determinar a seqüência do DNA recém sintetizado (Figura 36). Este método ainda é amplamente utilizado, sendo que vários avanços tornaram o seqüenciamento de DNA uma técnica simples e rápida. Os principais avanços foram a adaptação da PCR ao método de terminação da cadeia e a utilização de didesoxirribonucleotídeos marcados com diferentes corantes fluorescentes (fluorocromos). A utilização de fluorocromos permite que todas as quatro reações sejam realizadas em um único tubo e o produto da reação de seqüenciamento seja separado em uma única raia do gel.
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58 Figura 36 . Seqüenciamento de nucleotídeos pelo método do término do crescimento da cadeia. Lehninger, Principles of Biochemistry. Figura 10-36, p. 352.
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