Figura 9- Representación de un
ESPECTROGRAMA
o
ESPECTRO de ABSORCIÓN
de un analito. A es la banda de
longitudes de onda centrada en
λ1 y B es la banda de longitudes
de onda centrada en λ2.
Si analizamos la banda centrada en la longitud de onda λ
2, vemos que no habrá gran
variación en la lectura de absorbancia a lo largo de esa banda. Por el contrario la banda
centrada en la longitud de onda λ
1,
muestra una variación importante en la lectura de
absorbancia a lo largo de la banda. Concretamente, para tener un pequeño error debemos
elegir una longitud de onda ubicada en una región plana del espectrograma correspondiente
a fin de minimizar este error instrumental.
λ1
λ
2
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica
12
3- COMPONENTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO UV-VIS
1- Fuente de luz policromática (para el visible lámpara de Tungsteno y para UV lámpara de
deuterio).
2- Sistema óptico necesario para seleccionar una determinada longitud de onda (colimador,
monocromador, selector de longitud de onda).
3- Cubeta (recipiente donde se coloca la muestra a medir, para el visible debe ser de vidrio
o de plástico; para UV de cuarzo). Muchas veces al
camino óptico
(b) se lo denomina
ancho de la cubeta
.
4- Detector (Fototubo).
5- Procesador y lector de la señal.
Figura 10- Representación esquemática de los componentes del Espectrofotómetro.
4-
¿CÓMO
PUEDO
DETERMINAR
LA
CONCENTRACIÓN
DE
UN
ANALITO UTILIZANDO LA ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN
MOLECULAR UV-VIS?
4.1- Utilizando la ley de Lambert y Beer
Se aplica cuando se conoce el valor del coeficiente de Absortividad Molar para el
analito que queremos cuantificar a la longitud de onda de trabajo y en la solución utilizada
(datos de bibliografía). En estos casos medimos la absorbancia de la muestra a analizar y
utilizando la Ley de Lambert Beer podemos despejar el valor de la concentración. Esta
modalidad de trabajo es la que se utiliza para medir pigmentos en extractos vegetales o
productos agroindustriales.
1-
2-
3-
4-
5-
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica
13
4.2- Utilizando el procedimiento de la curva de calibración
Se aplica cuando los valores del coeficiente de Absortividad Molar no se conoce y
en los casos en los que se necesita realizar una reacción previa para lograr que el analito se
transforme en una especie absorbente. En la práctica generalmente el analito no absorbe
luz visible, pero es fácil transformarlo en una especie absorbente mediante una reacción
previa que lo transforme en un compuesto coloreado (por lo tanto que absorbe en el
visible).
En este procedimiento es necesario preparar una serie de soluciones de
concentración conocida del analito que queremos cuantificar, hacer la reacción previa para
generar el compuesto absorbente y luego medir la ABSORBANCIA de estas soluciones
coloreadas en el ESPECTROFOTOMETRO UV-Vis. Tendremos entonces una tabla de
datos correspondientes a pares ordenados (x,y) conocidos, los que podremos representar
en un gráfico de ejes cartesianos. En el eje de las X se representan las concentraciones
