Aquí se muestran dos cromatografías una de

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Aquí se muestran dos cromatografías, una de intercambio iónico y un cromatoenfoque. En la primera, la columna no tiene capacidad de amortiguación, mientras que en el cromatoenfoque sí. Aquí en vez de formar el gradiente, solo se utiliza una disolución, es decir, añadimos una elución isocrática. En intercambio iónico, como no hay capacidad de amortiguación, eluiremos todas las proteínas que tengan pI superior al del pH, siguiendo con el ejemplo de intercambio aniónico. En cambio, en cromatoenfoque, esas proteínas en su pI se soltarán, viajarán con la fase móvil, pero se volverán a quedar retenidas hasta que se vuelva a llegar a su pI.
31 Aquí se aplica mioglobina, cuando avanza cierta distancia, se añade más mioglobina, que avanza muy rápido, ya que no se une a la fase estacionaria, y cuando alcanza la primera banda, ambas muestras corren a la misma velocidad, por lo que tenemos un efecto concentrante. Cuando tenemos pI diferentes, primero añadimos la que tiene el pI más bajo, luego la del más alto. Cuando ambas lleguen al mismo punto se concentrarán, pero al final eluirá primero la que tenga pI más alto, por eso la añadimos en segundo lugar. El cromatoenfoque tiene un problema, ya que las proteínas no suelen tender a estar en su pI, porque a pH=pI precipitan, presentando un mínimo de solubilidad. 8.6.2. Cromatografía de hidrofobicidad. En este tipo de cromatografía, lo que actúa como fase estacionaria es un sólido que tiene unido grupos apolares . Las moléculas a separar interaccionarán más o menos en función de su propia estructura hidrofóbica y su contenido en regiones hidrofóbicas. En este caso están representadas
32 tres moléculas y sus regiones hidrofóbicas son las que tienen color rojo. Las que tienen más color rojo interaccionarán de una manera más fuerte, ya que su región hidrofóbica es más grande. En general, una fuerza iónica muy elevada, favorece la interacción hidrofóbica. Durante la elución, se usa como fase móvil una disolución distinta. Por lo tanto, durante la elución se usa una fase móvil que contiene algo que provoca la disociación de los solutos con la fase estacionaria, reduciendo la fuerza iónica o utilizando solventes orgánicos que sean más apolares para romper la primera interacción y permitir que eluyan los solutos de interés. Entonces se usa un gradiente decreciente de fuerza iónica para debilitar la interacción de los solutos que se unen a la fase estacionaria. También le puedes añadir algo que debilite la interacción, como algún solvente orgánico. La fase móvil es cambiante, es decir, en este tipo de cromatografía no se realiza una elución isocrática. Se ponen condiciones que facilitan la interacción al principio, pero luego se emplean condiciones que favorecen la separación. Disuelves la muestra con mucha sal y luego para eluirlo bajas la concentración de sal o añades un solvente orgánico o detergente. La temperatura también es muy importante, ya que una elevada temperatura no favorece las interacciones hidrofóbicas. Los soportes cromatográficos, es decir, lo solido puede ser lo mismo que es sólido en

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