Electroforesis vertical Empleada de forma exclusiva con gel de poliacrilamida

Electroforesis vertical empleada de forma exclusiva

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Electroforesis vertical Empleada de forma exclusiva con gel de poliacrilamida, se utiliza para proteínas o ácidos nucleicos de pequeño tama- ño. El gel debe estar contenido entre dos placas rectangula- res de vidrio donde la corriente eléctrica se genera gracias al buffer en el que se encuentra embebido el gel y llena las cubetas o compartimientos del ánodo y el cátodo como se aprecia en la figura 13-9. Procedimiento general de una electroforesis A continuación se exponen los pasos de los que consta una electroforesis típica. Figura 13-7. Marcadores de peso molecular para DNA. En la imagen el primer carril corresponde a las bandas que se obtienen de los fragmentos con un marcador como es el fago Phi X174 digerido por la enzima Hae III, mientras el segundo carril muestra los fragmentos de una escalera formada por segmentos sintéticos de DNA. 1 353 1 078 872 5 000 12 000 2 000 1 650 1 000 850 650 500 400 300 200 100 603 310 271 281 234 194 188 72
Metodología del DNA recombinante 122 1. Preparar un gel de agarosa o acrilamida a la concentra- ción requerida. 2. Mezclar las muestras a analizar con un buffer de carga adecuado. 3. Cargar las muestras en el gel. 4. Realizar la corrida electroforética al voltaje pertinente. 5. Visualizar los ácidos nucleicos o las proteínas. Electroforesis de ácidos nucleicos El método más común para la electroforesis de DNA es elaborar un gel horizontal de agarosa, con una concentra- ción de 0.5 a 2%. La carga eléctrica de la molécula de DNA la otorgan sus grupos fosfato, de carga negativa, y cuyo nú- mero es igual al doble del número de pares de bases. Dado que la forma de la molécula de DNA siempre es la misma, la movilidad de la electroforesis dependerá únicamente de la longitud del DNA (pb) y se representará en bandas (figura 13-10). El corrimiento se realiza a voltajes de entre 25 y 100 V; a mayor voltaje mayor velocidad de corrimien- to. El avance electroforético se monitorea a través de la vi- sualización de los colorantes (azul de bromofenol y azul de xileno) contenidos en el buffer de carga con el que se mez- cló la muestra previa a su colocación en el pocillo. Si los fragmentos de DNA son pequeños (menos de 50 pb) o bien se requiere discernir entre fragmentos de ácidos nucleicos con una diferencia de longitud de 1 a 20 pb, se recomienda utilizar un gel de poliacrilamida que permita esta resolu- ción. Las agarosas con un punto de fusión bajo permiten la preparación de geles a elevadas concentraciones y se acon- seja para obtener una buena separación de moléculas de DNA con < 1 000 pb. Son ideales para preparar geles analí- ticos de productos procedentes de técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction ) u otras. Algunas son capaces de separar fragmentos que difieren entre 10 y 20 pb. Para la preparación del gel debe estandarizarse primero qué concentración de agarosa es la más adecuada, según la muestra que se desee separar.

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